Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
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लेखक ईमानदारी से प्रो सारा एम. फॉर्च्यून को धन्यवाद देते हैं कि कृपया एम. स्मेगमैटिस एमसी2155 स्टॉक साझा करें। वे चित्रा 1 के लिए कुछ बुनियादी तत्व प्रदान करने के लिए सर्वियर मेडिकल आर्ट (smart.servier.com) को भी स्वीकार करते हैं। वे ईमानदारी से एमईवी संवर्धन के लिए इनक्यूबेटर शेकर्स, सेंट्रीफ्यूज और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज के लंबे उपयोग के दौरान अपने रोगी समायोजन के लिए बाकी प्रयोगशाला सदस्यों के समर्थन को स्वीकार करते हैं। वे प्रयोगशाला सहायक श्री सुरजीत यादव को भी हमेशा यह सुनिश्चित करने के लिए स्वीकार करते हैं कि आवश्यक कांच के बने पदार्थ और उपभोग्य वस्तुएं हमेशा उपलब्ध और आसान हों। अंत में, वे THSTI की प्रशासनिक, खरीद और वित्त टीमों को उनके निरंतर समर्थन और परियोजना के निर्बाध निष्पादन में मदद के लिए स्वीकार करते हैं।

1. माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस, एस्चेरिचिया कोलाई और उनके डेरिवेटिव की वृद्धि की स्थिति
<ol><li>मीडिया<ol><li>मिडलब्रुक 7H9 तरल शोरबा<ol><li>एक माइक्रोवेव में ~ 45-50 ओसी के लिए एक ग्लास बी?...

चूंकि एक नया टीबी वैक्सीन विकसित करना जो बीसीजी से बेहतर है और उसकी जगह ले सकता है, एक विकल्प के रूप में, कई समूह विभिन्न सबयूनिट टीबी टीकों की खोज का पीछा कर रहे हैं जो बीसीजी की शक्ति को बढ़ा सकते हैं और ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

संक्रामक रोगों के खिलाफ टीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास और प्रशासन के बावजूद, आज भी, सभी मानव मौतों का ~ 30% अभी भी संचारी रोगों से होता है1. क्षय रोग (टीबी) के टीके के आगमन से पहले - बैसिलस कैलमेट गुएरिन (बीसीजी) - टीबी नंबर एक हत्यारा था (~ 10,000 से 15,000/100,000 जनसंख्या)2. बीसीजी के प्रशासन और पहली और दूसरी पंक्ति की टीबी रोधी दवाओं तक आसान पहुंच के साथ, 2022 तक, टीबी से संबंधित मौतें नाटकीय रूप से घटकर ~1 मिलियन/वर्ष 2022 तक आ गई हैं (यानी, ~15-20/100,000 जनसंख्या1)। हालांकि, दुनिया की टीबी स्थानिक आबादी में, टीबी से संबंधित मौतें ~ 100-550 / 100,000 जनसंख्या1 पर खड़ी हैं। जबकि विशेषज्ञ इन विषम संख्याओं के लिए कई कारणों को पहचानते हैं, बीसीजी-मध्यस्थता सुरक्षा जीवन के पहले दशक तक भी नहीं टिकती है, प्रमुख कारण 3,4,5,6,7 प्रतीत होता है। नतीजतन, संयुक्त राष्ट्र के नए सिरे से 'सतत विकास लक्ष्यों' और डब्ल्यूएचओ की 'टीबी उन्मूलन रणनीति' को देखते हुए, बीसीजी के लिए एक बेहतर टीका विकल्प विकसित करने के लिए एक ठोस वैश्विक प्रयास है जो शायद टीबी से आजीवन सुरक्षा प्रदान करता है।

उस उद्देश्य की ओर, कई समूह वर्तमान में बीसीजी के अलावा संशोधित/पुनः संयोजक उपभेदों, गैर-रोगजनक और क्षीण माइकोबैक्टीरियल प्रजातियों का मूल्यांकन कर रहे हैं, और सबयूनिट उम्मीदवार 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . आमतौर पर, सबयूनिट टीके लिपोसोम होते हैं जो चुनिंदा रूप से रोगज़नक़ के कुछ शुद्ध (~ 1-6) पूर्ण-लंबाई या काटे गए इम्युनोजेनिक प्रोटीन से भरे होते हैं। हालांकि, गैर-देशी अनुरूपताओं और/या लोड किए गए प्रोटीनों के बीच यादृच्छिक गैर-कार्यात्मक बातचीत में उनके नकली तह के कारण, सबयूनिट्स में अक्सर देशी और जर्मन एपिटोप्स की कमी होती है और इसलिए, प्रतिरक्षा प्रणाली14,19,20 को पर्याप्त रूप से प्राइम करने में विफल रहते हैं।

नतीजतन, बैक्टीरिया के बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) ने एक आशाजनक विकल्प के रूप में गति पकड़ी है 21,22,23,24,25,26. आमतौर पर, बैक्टीरियल ईवीएस (बीईवी) में उनके सेलुलर घटकों का एक सबसेट होता है, जिसमें न्यूक्लिक एसिड, लिपिड और सैकड़ों मेटाबोलाइट्स और प्रोटीन27,28के कुछ हिस्से शामिल हैं। लिपोसोम के विपरीत जहां कुछ शुद्ध प्रोटीन कृत्रिम रूप से लोड होते हैं, बीईवी में सैकड़ों स्वाभाविक रूप से भरी हुई, मूल रूप से मुड़े हुए प्रोटीन होते हैं, जो प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रमुख बनाने के लिए बेहतर प्रवृत्ति के साथ होते हैं, विशेष रूप से सहायक और टोल-जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) एगोनिस्ट27,28,29 के बूस्ट/सहायता के बिना। यह अनुसंधान की इस पंक्ति में है कि हमने और अन्य ने बीसीजी30 के लिए संभावित सबयूनिट बूस्टर के रूप में माइकोबैक्टीरियल ईवीएस की उपयोगिता का पता लगाया है। चिंताओं के बावजूद कि बीईवी में समान एंटीजन लोड की कमी है, क्षीण नेइसेरिया मेनिंगिटिडिस से ईवीएस ने सफलतापूर्वक सेरोग्रुप बी मेनिंगोकोकस31,32 के खिलाफ मनुष्यों की रक्षा की है।
कम से कम सैद्धांतिक रूप से, सबसे अच्छा ईवी जो बीसीजी को अच्छी तरह से बढ़ावा दे सकता है, वे रोगजनक बैक्टीरिया से समृद्ध ईवीएस हैं। हालांकि, रोगजनक माइकोबैक्टीरियम द्वारा उत्पन्न ईवीएस को समृद्ध करना महंगा, समय लेने वाला और जोखिम भरा है। इसके अतिरिक्त, रोगज़नक़ जनित ईवीएस सुरक्षात्मक की तुलना में अधिक विषैले हो सकते हैं। संभावित जोखिमों को देखते हुए, यहां, हम अक्षीय रूप से उगाए गए एमएसएम, एक एविरुलेंट माइकोबैक्टीरियम द्वारा उत्पन्न ईवीएस के संवर्धन के लिए एक अच्छी तरह से परीक्षण किए गए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।
हालांकि, कई रोगज़नक़ प्रोटीन ऑर्थोलॉग एन्कोडिंग के बावजूद, एविरुलेंट माइकोबैक्टीरिया में कई वैक्सीन एंटीजन/रोगजनक प्रोटीन एपिटोप्स की कमी होती है जो प्रतिरक्षा प्रणाली को सुरक्षा33 की दिशा में पर्याप्त रूप से प्राइम करने के लिए आवश्यक होते हैं। इसलिए, हमने आणविक इंजीनियरिंग के माध्यम से एमएसएम के पुनः संयोजक ईवीएस के निर्माण और समृद्ध करने का भी पता लगाया, जैसे कि एमएसएम में व्यक्त और अनुवादित ब्याज के किसी भी रोगजनक प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा, अपने ईवीएस तक पहुंचना चाहिए। हमने अनुमान लगाया कि एमएसएम ईवीएस के शीर्ष 10 प्रचुर मात्रा में प्रोटीन में से एक या अधिक जब ब्याज के प्रोटीन से जुड़े होते हैं, तो इस तरह के अनुवाद में सहायता मिलेगी।
जबकि हम अपनी प्रयोगशाला में माइकोबैक्टीरियल ईवीएस (एमईवी) के संवर्धन को मानकीकृत करना शुरू कर रहे थे, 2011 में, प्राडोस-रोजलेस एट अल ने पहली बार इन विट्रो30 में एमईवी के विज़ुअलाइज़ेशन और संवर्धन की सूचना दी। बाद में, 2014 में, उसी समूह ने अपनी 2011 विधि34 का एक संशोधित संस्करण प्रकाशित किया। 2015 में, ली एट अल ने माइकोबैक्टीरिया35 के अक्षीय संस्कृतियों से फिर से एमईवी संवर्धन के लिए एक स्वतंत्र रूप से मानकीकृत विधि की सूचना दी। दोनों प्रोटोकॉल34,35 के संयोजन और पूरी तरह से मानकीकरण के बाद हमारे संशोधनों में से कुछ को शामिल करते हुए, हम यहां एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो माइकोबैक्टीरिया 36 की अक्षीय संस्कृतियों से नियमित रूप से समृद्ध एमईवी में मदद करता है।
यहां, हम विशेष रूप से एमएसएम-विशिष्ट ईवीएस के संवर्धन का विस्तार करते हैं, जो सामान्य रूप से माइकोबैक्टीरियल ईवीएस के संवर्धन के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल36 का विस्तार है। हम यह भी विस्तार से बताते हैं कि पुनः संयोजक mEVs (R-mEVs) का निर्माण कैसे किया जाए जिसमें mCherry प्रोटीन (लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में) और EsxA (Esat-6)37,38,39 एक प्रमुख इम्युनोजेन और माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का एक संभावित सबयूनिट वैक्सीनोजेन शामिल है। आर-एमईवी को समृद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल उसी के समान है जिसे हमने एमएसएम से देशी ईवीएस को समृद्ध करने के लिए वर्णित किया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

माइकोबैक्टीरिया सहित अधिकांश बैक्टीरिया, बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) उत्पन्न करते हैं। चूंकि बैक्टीरियल ईवीएस (बीईवी) में मेटाबोलाइट्स, लिपिड, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित सेलुलर घटकों का एक सबसेट होता है, इसलिए कई समूहों ने सबयूनिट वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में अपनी सुरक्षात्मक शक्ति के लिए बीईवी के मूल या पुनः संयोजक संस्करणों का मूल्यांकन किया है। देशी ईवीएस के विपरीत, पुनः संयोजक ईवीएस को आणविक रूप से ब्याज के एक या अधिक इम्युनोजेन्स को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जाता है। पिछले दशक में, विभिन्न समूहों ने पुनः संयोजक बीईवी उत्पन्न करने के लिए विविध दृष्टिकोणों का पता लगाया है। हालांकि, यहां, हम माइकोबैक्टीरिया में पुनः संयोजक माइकोबैक्टीरियल ईवीएस (एमईवी) के डिजाइन, निर्माण और संवर्धन की रिपोर्ट करते हैं। इसके लिए, हम माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस (Msm) का उपयोग करते हैं, जो मॉडल प्रणाली के रूप में एक विषैला मिट्टी माइकोबैक्टीरियम है। हम पहले एमएसएम के देशी ईवीएस की पीढ़ी और संवर्धन का वर्णन करते हैं। फिर, हम पुनः संयोजक mEVs के डिजाइन और निर्माण का वर्णन करते हैं जिसमें या तो mCherry, एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन, या EsxA (Esat-6), माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का एक प्रमुख इम्युनोजेन होता है। हम इसे एक छोटे एमएसएम प्रोटीन सीएफपी -29 के सी-टर्मिनस के साथ अलग से mCherry और EsxA N-termini को फ्यूज करके प्राप्त करते हैं। Cfp-29 MsmEVs के कुछ प्रचुर मात्रा में मौजूद प्रोटीनों में से एक है। एमएसएम से पुनः संयोजक एमईवी उत्पन्न करने और समृद्ध करने का प्रोटोकॉल एमएसएम के देशी ईवी के उत्पादन और संवर्धन के समान है।

हम देशी और पुनः संयोजक mEVs (R-mEVs) दोनों के संवर्धन को प्रदर्शित करने के लिए मॉडल माइकोबैक्टीरियम के रूप में M. smegmatis (Msm) का उपयोग करते हैं। यह योजनाबद्ध रूप से सारांशित एमईवी संवर्धन प्रोटोकॉल(चित्र?...

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Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

यह प्रोटोकॉल माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस (एमएसएम) की अक्षीय संस्कृतियों से देशी माइकोबैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (एमईवी) के संवर्धन का विवरण देता है और कैसे mCherry (एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर) युक्त पुनः संयोजक MsmEVs को डिजाइन और समृद्ध किया जा सकता है। अंत में, यह माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस के एस्क्सा प्रोटीन युक्त MsmEVs के संवर्धन के साथ उपन्यास दृष्टिकोण की पुष्टि करता है।

माइकोबैक्टीरिया के देशी और पुनः संयोजक बाह्य पुटिकाओं का संवर्धन

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

माइकोबैक्टीरियल ईवीएस को समृद्ध करने से उनकी सामग्री को चित्रित करने, उनके गुटों और तिथियों को पुनः संयोजक ईवी बनाने और उत्पन्न करने के तरीकों को डिजाइन करने में मदद मिलती है जो मुख्य रूप से वैक्सीन उम्मीदवारों का शोषण करते हैं। छह श्रृंखला बैक्टीरिया की सतह के विभिन्न स्थानों से उत्पन्न होती है। उनके पास संरक्षित मार्कर नहीं हैं।इसलिए, कोई भी आत्मीयता-आधारित दृष्टिकोण ईवीएस के केवल एक सबसेट को समृद्ध कर सकता है। इसके विपरीत, हमारी विधि सभी उत्पन्न माइकोबैक्टीरिया ईवीएस को कैप्चर करती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मोहम्मद इलियास करेंगे, जो मेरी प्रयोगशाला से पीएचडी के छात्र हैं।शुरू करने के लिए, जंगली प्रकार या पुनः संयोजक माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस के ग्लिसरॉल स्टॉक का एक मिलीलीटर 50-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें जिसमें 10 मिलीलीटर पूर्व-गर्म 7H9 शोरबा हो। ढक्कन बंद करें और 200 से 220 आरपीएम के बीच 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति को इनक्यूबेट करने से पहले ट्यूब को घुमाएं। अगले दिन, जब 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व लगभग एक तक पहुंच जाता है, तो कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3, 200 ग्राम पर संस्कृति को अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला को तरल त्यागने वाले कंटेनर में त्याग दें।पूर्व-गर्म सॉटन मीडिया का एक मिलीलीटर जोड़ें और एक समान निलंबन प्राप्त करने के लिए धीरे से फिर से निलंबित करें। Sautons मीडिया का उपयोग करके वॉल्यूम को 10 मिलीलीटर तक बनाएं। फिर से अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।धोने के बाद, बैक्टीरिया कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 20 मिलीलीटर पूर्व-गर्म Sautons मीडिया में और 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापते हैं। बैक्टीरियल सस्पेंशन की आवश्यक मात्रा को एक से दो लीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में टीका लगाएं जिसमें 330 मिलीलीटर सॉटन मीडिया होता है और ऑप्टिकल घनत्व 0.3 तक पहुंचने तक 200 आरपीएम में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है।अगले दिन, कोशिकाओं को एक बार धो लें जैसा कि पहले दिखाया गया था और 330 मिलीलीटर सॉटन में गोली को फिर से निलंबित कर दिया गया था जिसमें 1/10 ट्वीन 80 था। सेल निलंबन के 50 मिलीलीटर को छह एक-लीटर फ्लास्क में वितरित करें, प्रत्येक में 280 मिलीलीटर प्री-वार्म्ड सॉटन होते हैं जिसमें 1/10 ट्वीन 80 होते हैं। 200 आरपीएम में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें जब तक कि ऑप्टिकल घनत्व दो से 2.5 तक न पहुंच जाए।छह 400-मिलीलीटर की बोतलों में दो लीटर मध्य-घातीय चरण संस्कृतियों को जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 8, 000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला और पूर्व ठंडा autoclaved बोतल या बीकर लीजिए और विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के लिए गोली का एक विभाज्य की दुकान. गोली रंगीन होती है यदि ईवीएस एमचेरी के लिए पुनः संयोजक होते हैं और भूरे रंग के होते हैं यदि वे जंगली-प्रकार या गैर-फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए पुनः संयोजक होते हैं।बैक्टीरिया के सभी निशान को हटाने के लिए 0.22-माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन के बाद 0.45-माइक्रोन निपटान फिल्टर के माध्यम से संस्कृति सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर करें। इसके बाद, 30-किलोडाल्टन झिल्ली सांद्रता को 15 मिलीलीटर डबल-डिस्टिल्ड पानी के साथ 4, 000 ग्राम पर 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर प्री-वॉश करें। फिर रसायनों के सभी निशान हटाने के लिए समान परिस्थितियों का उपयोग करके पूर्व-फ़िल्टर्ड ठंडे सॉटन मीडिया के 15 मिलीलीटर के साथ धो लें।धोने के बाद, एक सांद्रक में फ़िल्टर्ड सुसंस्कृत सतह पर तैरनेवाला के 15 मिलीलीटर जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4, 000 ग्राम पर ध्यान केंद्रित. ध्यान को ठंडे 40-मिलीलीटर ओक रिज अपकेंद्रित्र ट्यूब या 50-मिलीलीटर ताजा फाल्कन अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक बार जब पूरे दो लीटर कल्चर फिल्ट्रेट केंद्रित हो जाता है, तो ध्यान को एक डबल डिस्टिल्ड, धोया और पूर्व-ठंडा 50-मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और दो-चरण सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन करें।पहले 4, 000 जी पर, और फिर 15, 000 जी पर, सेंट्रीफ्यूज को प्री-चिल्ड 38.5-मिलीलीटर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और चार डिग्री सेल्सियस पर चार घंटे के लिए 100, 000 जी पर स्पिन करें। एक पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर ताजा फाल्कन अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए. सतह पर तैरनेवाला के निशान को हटाने के लिए एक ताजा, लिंट-फ्री शोषक कागज पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को उल्टा करें और HEPES बफर के 600 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।एक 13 मिलीलीटर पूर्व ठंडा UltraClear पॉलीप्रोपाइलीन ultracentrifuge ट्यूब के तल पर resuspended गोली परत और धीरे निष्क्रिय 60% घनत्व ढाल iodixanol समाधान के चार मिलीलीटर के साथ मिश्रण. फिर एक मिलीलीटर के साथ ओवरले 40%, 30%, 20% और 10% आयोडिक्सानोल का। शीर्ष पर 6% iodixanol के चार मिलीलीटर जोड़कर ट्यूब भरें।ध्यान से एक गिलास बीकर या एक स्टैंड में ट्यूब वजन के बाद, धीरे झूलते बाल्टी में और फिर चार डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 141, 000 जी पर ultracentrifugation के लिए झूलते बाल्टी रोटर के लिए हस्तांतरण. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ट्यूब को ध्यान से हटा दें और ऑटोक्लेव्ड माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक मिलीलीटर अंश इकट्ठा करें। टीईएम विश्लेषण से पता चला है कि एक माइकोबैक्टीरियल ईवीएस गोलाकार हैं और नैनो-ट्रैकिंग विश्लेषण ने 20 और 250 नैनोमीटर के बीच व्यास वाले विभिन्न आकार के ईवी की पुष्टि की।जब mCherry के N-टर्मिनल छोर को CFP-29 के सी-टर्मिनल छोर पर अनुवादित रूप से जोड़ा गया था, तो Msm के समृद्ध mEVs का एक हिस्सा गुलाबी हो गया, जो cf-29 की विदेशी प्रोटीन को ले जाने की क्षमता को दर्शाता है। सीएफपी -29 का उपयोग तब एमएसएम ईवी में ईएसएक्सए डिलीवरी का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। एमटीबी का एस्क्सा कम मात्रा में एमएसएम ईवी में देखा गया था।CFP-29 EsxA 3X FLAG अधिक स्थिर था और mEVs में उच्च स्तर पर जमा हुआ था। शारीरिक विभिन्न परिस्थितियों में उगाए गए माइकोबैक्टीरिया से ईवीएस को समृद्ध करना उनकी परिवर्तित सामग्री और संशोधित कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो निरंतर संक्रामकता, रोगजनन और रोगज़नक़ प्रसार को निर्देशित करते हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

पुनः संयोजक इन्फ्लुएंजा वायरस के डीएनए प्लाज्मिड से पीढ़ी

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

पुनः संयोजक रेट्रोवायरल बी कोशिकाओं का उत्पादन और संक्रमण

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

उत्पादन और पुनः संयोजक एडिनो जुड़े वायरल वैक्टर Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

मिलान विशेष टी कोशिकाओं की MHC tetramer आधारित संवर्धन: पेप्टाइड

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

सीडीएनए से संयोजक न्यूकासल रोग वायरस का बचाव

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

अर्द्ध मात्रात्मक, मध्यम throughput माइक्रोबैक्टीरिया की गणना के लिए लकड़ी का कोयला अग्रवाल Resazurin परख के दृश्य

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Virometry प्रवाह virions की प्रतिजनी स्पेक्ट्रा और बाह्य Vesicles का विश्लेषण करने के लिए

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

अलगाव और वयस्क Schistosoma japonicum से Extracellular बुलबुले के लक्षण वर्णन

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

एक Ultrafiltration केंद्रापसारक तकनीक का उपयोग Murine Bronchoalveolar लेवेज द्रव से Extracellular बुलबुले के अलगाव

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

पीढ़ी, प्रवर्धन, और पुनः संयोजक श्वसन Syncytial वायरस के टाइट्रेट

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...