Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
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Gli autori ringraziano sinceramente la Prof.ssa Sarah M. Fortune per aver gentilmente condiviso le scorte di M. smegmatis mc2155. Riconoscono inoltre a Servier Medical Art (smart.servier.com) di aver fornito alcuni elementi di base per la Figura 1. Riconoscono sinceramente il supporto del resto dei membri del laboratorio per le regolazioni dei loro pazienti durante il lungo uso degli agitatori dell'incubatore, delle centrifughe e delle ultracentrifughe per l'arricchimento mEV. Riconoscono anche il signor Surjeet Yadav, l'assistente di laboratorio, per essersi sempre assicurato che la vetreria e i materiali di consumo necessari fossero sempre disponibili e a portata di mano. Infine, ringraziano i team amministrativi, di acquisto e finanziari di THSTI per il loro costante supporto e aiuto nell'esecuzione senza soluzione di continuità del progetto.

1. Condizioni di crescita di Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli e loro derivati
<ol><li>Media<ol><li>Brodo liquido Middlebrook 7H9<ol><li>Preparare la soluzione madre Tween-80 al 20% preriscaldando il volume richiesto di acqua bidistillata (ddw) in un bicchiere di vetro a ~45-50 oC in un microonde, aggiungere il volume richiesto di Tween-80 utilizzando un cilindro graduato appropriato e agitare continuamente su un piccolo agitatore m...

Poiché lo sviluppo di un nuovo vaccino contro la tubercolosi che sia superiore e in grado di sostituire il BCG rimane una sfida formidabile, in alternativa, diversi gruppi stanno perseguendo la scoperta di diversi vaccini contro la tubercolosi a subunità che possano aumentare la potenza del BCG e prolungarne la durata protettiva48,49. Data la crescente attenzione alle vescicole extracellulari batteriche (bEV) come potenziali subunità e come adiuvanti naturali<...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Nonostante lo sviluppo e la somministrazione di un'ampia gamma di vaccini contro le malattie infettive, ancora oggi, ~30% di tutti i decessi umani si verifica ancora a causadi malattie trasmissibili. Prima dell'avvento del vaccino contro la tubercolosi (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - la tubercolosi era il killer numero uno (~10.000-15.000/100.000 abitanti)2. Con la somministrazione di BCG e il facile accesso ai farmaci antitubercolari di prima e seconda linea, entro il 2022, i decessi correlati alla tubercolosi sono drasticamente scesi a ~ 1 milione / anno entro il 2022 (cioè, ~ 15-20/100.000 popolazione1). Tuttavia, nelle popolazioni endemiche di tubercolosi del mondo, i decessi correlati alla tubercolosi continuano a attestarsi a ~100-550/100.000 abitanti1. Sebbene gli esperti riconoscano diverse ragioni che portano a questi numeri distorti, la protezione mediata da BCG che non dura nemmeno per la prima decade di vita sembra essere la ragione principale 3,4,5,6,7. Di conseguenza, dati i rinnovati "Obiettivi di Sviluppo Sostenibile" delle Nazioni Unite e la "Strategia End TB" dell'OMS, c'è uno sforzo globale concertato per sviluppare un vaccino alternativo molto superiore al BCG che forse fornisca una protezione permanente dalla tubercolosi.

A tal fine, diversi gruppi stanno attualmente valutando ceppi di BCG modificati/ricombinanti, specie micobatteriche non patogene e attenuate diverse dal BCG e candidati subunità 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Tipicamente, i vaccini a subunità sono liposomi caricati selettivamente con poche proteine immunogeniche purificate (~1-6) a lunghezza intera o troncate del patogeno. Tuttavia, a causa del loro ripiegamento spurio in conformazioni non native e/o interazioni casuali non funzionali tra le proteine caricate, le subunità spesso mancano di epitopi nativi e germanici e, quindi, non riescono a innescare sufficientemente il sistema immunitario14,19,20.

Di conseguenza, le vescicole extracellulari (EV) dei batteri hanno preso piede come alternativa promettente 21,22,23,24,25,26. Tipicamente, le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme dei loro componenti cellulari, tra cui alcune porzioni di acidi nucleici, lipidi e centinaia di metaboliti e proteine27,28. A differenza dei liposomi in cui poche proteine purificate sono caricate artificialmente, le bEV contengono centinaia di proteine caricate naturalmente e ripiegate in modo nativo con una migliore propensione a innescare il sistema immunitario, specialmente senza la spinta / aiuto di adiuvanti e agonisti del recettore Toll-like (TLR)27,28,29. È in questa linea di ricerca che noi e altri abbiamo esplorato l'utilità delle vescicole extracellulari micobatteriche come potenziali booster di subunità per BCG30. Nonostante le preoccupazioni che le vescicole extracellulari manchino di carichi antigenici uniformi, le vescicole extracellulari di Neisseria meningitidis attenuata hanno protetto con successo gli esseri umani contro il meningococco di sierogruppoB 31,32.
Almeno in teoria, le migliori vescicole extracellulari che potrebbero aumentare bene il BCG sono le vescicole extracellulari arricchite da batteri patogeni. Tuttavia, l'arricchimento delle vescicole extracellulari generate da micobatteri patogeni è costoso, dispendioso in termini di tempo e rischioso. Inoltre, le vescicole extracellulari generate da agenti patogeni possono essere più virulente che protettive. Dati i potenziali rischi, riportiamo qui un protocollo ben collaudato per l'arricchimento di vescicole extracellulari generate da Msm coltivato assinicamente, un micobatterio avirulento.
Tuttavia, nonostante codifichino diversi ortologhi di proteine patogene, i micobatteri avirulenti mancano di diversi antigeni vaccinali/epitopi proteici patogeni necessari per preparare sufficientemente il sistema immunitario verso la protezione33. Pertanto, abbiamo anche esplorato la costruzione e l'arricchimento di vescicole extracellulari ricombinanti di Msm attraverso l'ingegneria molecolare, in modo tale che una porzione significativa di qualsiasi proteina patogena di interesse espressa e tradotta in Msm, debba raggiungere le sue vescicole extracellulari. Abbiamo ipotizzato che una o più delle prime 10 proteine abbondanti delle vescicole extracellulari Msm, una volta fuse con la proteina di interesse, aiutino in tale traslocazione.
Mentre stavamo iniziando a standardizzare l'arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche (mEV) nel nostro laboratorio, nel 2011, Prados-Rosales et al. hanno riportato per la prima volta la visualizzazione e l'arricchimento delle mEV in vitro30. Successivamente, nel 2014, lo stesso gruppo ha pubblicato una versione modificata del metodo34 del 2011. Nel 2015, Lee et al. hanno anche riportato un metodo standardizzato in modo indipendente per l'arricchimento di mEV sempre da colture axeniche di micobatteri35. Combinando entrambi i protocolli34,35 e incorporando alcune delle nostre modifiche dopo un'accurata standardizzazione, descriviamo qui un protocollo che aiuta ad arricchire regolarmente le mEV da colture axeniche di micobatteri36.
Qui, descriviamo in dettaglio l'arricchimento delle vescicole extracellulari specifiche per Msm, che è un'estensione di un protocollopubblicato 36 per l'arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche in generale. Descriviamo anche in dettaglio come costruire mEV ricombinanti (R-mEVs) che contengono la proteina mCherry (come reporter fluorescente rosso) ed EsxA (Esat-6)37,38,39, un immunogeno predominante e una potenziale subunità vaccinogeno di Mycobacterium tuberculosis. Il protocollo per l'arricchimento delle R-mEV rimane identico a quello che abbiamo descritto per l'arricchimento delle EV native da Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

La maggior parte dei batteri, compresi i micobatteri, genera vescicole extracellulari (EV). Poiché le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme di componenti cellulari, tra cui metaboliti, lipidi, proteine e acidi nucleici, diversi gruppi hanno valutato le versioni native o ricombinanti delle bEV per la loro potenza protettiva come candidati vaccini a subunità. A differenza delle vescicole extracellulari native, le vescicole extracellulari ricombinanti sono molecolarmente ingegnerizzate per contenere uno o più immunogeni di interesse. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi hanno esplorato diversi approcci per la generazione di bEV ricombinanti. Tuttavia, qui, riportiamo la progettazione, la costruzione e l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche ricombinanti (mEV) nei micobatteri. A tal fine, utilizziamo Mycobacterium smegmatis (Msm), un micobatterio avirulento del suolo come sistema modello. Per prima cosa descriviamo la generazione e l'arricchimento di vescicole extracellulari native di Msm. Quindi, descriviamo la progettazione e la costruzione di mEV ricombinanti che contengono mCherry, una proteina reporter fluorescente rossa, o EsxA (Esat-6), un importante immunogeno di Mycobacterium tuberculosis. Raggiungiamo questo risultato fondendo separatamente mCherry ed EsxA N-termini con il C-terminale di una piccola proteina Msm Cfp-29. Cfp-29 è una delle poche proteine abbondantemente presenti delle MsmEV. Il protocollo per generare e arricchire mEV ricombinanti da Msm rimane identico alla generazione e all'arricchimento di EV native di Msm.

Utilizziamo M. smegmatis (Msm) come micobatterio modello per dimostrare l'arricchimento di mEV sia native che ricombinanti (R-mEV). Questo protocollo di arricchimento di mEV schematicamente riassunto (Figura 1) funziona anche per l'arricchimento di R-mEV di Msm e EV nativi di Mtb (con piccole modifiche come nelle note di protocollo di 1.2). La visualizzazione delle mEV arricchite richiede la loro colorazione negativa al microscopio elettronicoa trasmissione 36</sup...

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Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l'arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

L'arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche aiuta a delineare il loro contenuto, decifrare le loro fazioni e datare progettando modi per costruire e generare vescicole extracellulari ricombinanti che sfruttano principalmente i candidati vaccini. Sei serie si generano da diverse posizioni della superficie batterica. Non hanno marcatori conservati.Pertanto, qualsiasi approccio basato sull'affinità può arricchire solo un sottoinsieme delle EV. Al contrario, il nostro metodo cattura tutte le vescicole extracellulari di micobatteri generate. A dimostrare la procedura sarà Mohd Ilyas, uno studente di dottorato del mio laboratorio.Per iniziare, aggiungere un millilitro di scorta di glicerolo di Mycobacterium smegmatis wild-type o ricombinante a una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente 10 millilitri di brodo 7H9 preriscaldato. Chiudere il coperchio e far roteare la provetta prima di incubare la coltura per una notte a 37 gradi Celsius tra 200 e 220 giri/min. Il giorno successivo, quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge circa uno, centrifugare la coltura a 3, 200 G per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante in un contenitore di scarto liquido.Aggiungere un millilitro di terreno Sautons preriscaldato e risospendere delicatamente per ottenere una sospensione uniforme. Portare il volume a 10 millilitri utilizzando i terreni Sautons. Centrifugare di nuovo ed eliminare il surnatante.Dopo il lavaggio, risospendere le cellule batteriche. in 20 millilitri di terreno Sauton preriscaldato e misurare la densità ottica a 600 nanometri. Inoculare il volume richiesto di sospensione batterica in un matraccio di Erlenmeyer da uno a due litri contenente 330 millilitri di terreno Sautons e incubare a 37 gradi Celsius in 200 giri/min fino a quando la densità ottica raggiunge 0,3.Il giorno successivo, lavare le celle una volta come dimostrato in precedenza e risospendere il pellet in 330 millilitri di Sautons contenenti 1/10 di Tween 80. Distribuire 50 millilitri della sospensione cellulare in sei palloni da un litro, ciascuno contenente 280 millilitri di Sauton preriscaldati contenenti 1/10 di Tween 80. Incubare le colture a 37 gradi Celsius a 200 RPM fino a quando la densità ottica raggiunge da due a 2,5.Aggiungere due litri di colture in fase esponenziale media a sei flaconi da 400 millilitri e centrifugare a 8.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere i palloni o i becher surnatanti e pre-raffreddati in autoclave e conservare un'aliquota del pellet per le procedure analitiche. Il pellet è colorato se le vescicole extracellulari sono ricombinanti per mCherry e marroni se sono wild-type o ricombinanti per proteine non fluorescenti.Filtrare il surnatante della coltura attraverso un filtro di smaltimento da 0,45 micron, seguito da una filtrazione attraverso un filtro da 0,22 micron per rimuovere tutte le tracce di batteri. Successivamente, prelavare i concentratori a membrana da 30 kilodalton con 15 millilitri di acqua bidistillata a 4.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare con 15 millilitri di terreno Sautons freddo pre-filtrato utilizzando le stesse condizioni per rimuovere tutte le tracce di sostanze chimiche.Dopo il lavaggio, aggiungere 15 millilitri di surnatante coltivato filtrato in un concentratore e concentrare a 4.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il concentrato in una provetta da centrifuga Oak Ridge fredda da 40 millilitri o in una provetta da centrifuga Falcon fresca da 50 millilitri. Una volta concentrati tutti i due litri di filtrato di coltura, trasferire il concentrato in una provetta da centrifuga in polipropilene da 50 millilitri a doppia distillazione, lavata e pre-raffreddata e sottoposta a una centrifugazione in due fasi.Prima a 4.000 G e poi a 15.000 G.Trasferire il concentrato centrifugato in una provetta da ultracentrifuga da 38,5 millilitri pre-raffreddata e centrifugare a 100.000 G per quattro ore a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in una provetta da centrifuga Falcon fresca da 50 millilitri pre-raffreddata. capovolgere la provetta dell'ultracentrifuga su una carta assorbente fresca e priva di lanugine per rimuovere le tracce del surnatante e risospendere il pellet in 600 microlitri di tampone HEPES.Stratificare il pellet risospeso sul fondo di una provetta per ultracentrifuga in polipropilene UltraClear pre-raffreddata da 13 millilitri e mescolare delicatamente con quattro millilitri di soluzione inerte di iodixanolo con gradiente di densità al 60%. Quindi sovrapporre con un millilitro ciascuno di 40%, 30%, 20% e 10% di iodiolo. Riempi il tubo aggiungendo quattro millilitri di iodixanolo al 6% nella parte superiore.Dopo aver pesato accuratamente la provetta in un bicchiere di vetro o in un supporto, trasferirla delicatamente nei secchi oscillanti e poi nel rotore dei secchi oscillanti per l'ultracentrifugazione a 141.000 G per 16 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere con cautela la provetta e raccogliere una frazione di un millilitro in provette per microcentrifuga sterilizzate in autoclave. L'analisi TEM ha mostrato che le vescicole extracellulari micobatteriche sono circolari e l'analisi di nano-tracciamento ha confermato vescicole extracellulari di dimensioni diverse con diametri compresi tra 20 e 250 nanometri.Quando l'estremità N-terminale di mCherry è stata fusa traslazionalmente con l'estremità C-terminale di CFP-29, una porzione di mEV arricchite di Msm è diventata rosa, indicando la capacità di cf-29 di trasportare una proteina estranea di interesse. CFP-29 è stato quindi utilizzato per valutare la consegna di EsxA negli EV Msm. L'EsxA di Mtb è stato osservato negli EV Msm in basse quantità.CFP-29 EsxA 3X FLAG è risultato più stabile e si è accumulato a livelli più elevati nelle mEV. L'arricchimento delle vescicole extracellulari da micobatteri cresciuti in condizioni fisiologiche diverse fornisce informazioni sul loro contenuto alterato e sulle funzioni modificate che determinano l'infettività sostenuta, la patogenesi e la diffusione dei patogeni.

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Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...