Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

저자는 M. smegmatis mc2155 주식을 친절하게 공유해 주신 Sarah M. Fortune 교수에게 진심으로 감사드립니다. 또한 그림 1의 몇 가지 기본 요소를 제공한 Servier Medical Art(smart.servier.com)를 인정합니다. 그들은 mEV 농축을 위해 인큐베이터 쉐이커, 원심분리기 및 초원심분리기를 장기간 사용하는 동안 환자 조정에 대한 나머지 실험실 구성원의 지원에 진심으로 감사드립니다. 또한 실험실 조교인 Surjeet Yadav 씨가 필요한 유리 제품과 소모품을 항상 사용할 수 있고 편리하게 사용할 수 있도록 해준 것에 대해 감사를 표합니다. 마지막으로, 그들은 프로젝트의 원활한 실행에 대한 지속적인 지원과 도움에 대해 THSTI의 관리, 구매 및 재무 팀에 감사드립니다.

1. Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli 및 그 유도체의 성장 조건
<ol><li>미디어<ol><li>미들브룩 7H9 액체 육수<ol><li>유리 비커에 필요한 양의 이중 증류수(ddw)를 전자레인지에서 ~45-50oC로 사전 데워 20% Tween-80 원액을 준비하고, 적절한 측정 실린더를 사용하여 필요한 부피의 Tween-80을 추가하고, 작은 자석 교반기에서 계속 저어 20% Tween-80을 균일?...

BCG보다 우수하고 BCG를 대체할 수 있는 새로운 결핵 백신을 개발하는 것은 여전히 만만치 않은 과제로 남아 있기 때문에, 대안으로 여러 그룹에서 BCG의 효능을 높이고 보호 기간을 연장할 수 있는 다양한 소단위 결핵 백신의 발견을 추구하고 있습니다48,49. 박테리아 EV(bEV)가 잠재적인 소단위체(subunit) 및 천연 보조제(natural adjuvants)50,51)?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

전염병에 대한 광범위한 백신의 개발 및 투여에도 불구하고 오늘날까지도 모든 인간 사망의 ~30%는 여전히 전염병으로 인해 발생합니다1. 결핵(TB) 백신인 Bacillus Calmette Guerin(BCG)이 등장하기 전에는 결핵이 사망 원인 1위였습니다(~10,000명에서 15,000명/100,000명)2. BCG의 투여와 1차 및 2차 항결핵제에 대한 쉬운 접근으로 2022년까지 결핵 관련 사망은 2022년까지 ~100만명/년으로 급격히 감소했다(즉, ~15-20/100,000 인구1). 그러나 전 세계 결핵 풍토병 인구에서 결핵 관련 사망자는 인구 100,000명당 ~100-550명에 머물고있다 1. 전문가들은 이러한 왜곡된 수치를 초래하는 몇 가지 이유를 인정하지만, BCG에 의한 보호가 생후 첫 10년 동안도 지속되지 않는 것이 3,4,5,6,7의 주된 원인인 것으로 보인다. 결과적으로, UN의 '지속가능발전목표'와 WHO의 '결핵 퇴치 전략'이 새로워짐에 따라, 결핵으로부터 평생 보호해 줄 수 있는 BCG보다 훨씬 우수한 백신을 개발하기 위한 전 세계적인 공동의 노력이 이루어지고 있습니다.

이 목표를 달성하기 위해 여러 그룹에서 현재 변형/재조합 BCG 균주, BCG 이외의 비병원성 및 약독화 마이코박테리아 종, 서브유닛 후보 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18을 평가하고 있습니다 . 일반적으로 서브유닛 백신은 병원체의 정제된(~1-6) 전장 또는 절단된 면역원성 단백질이 거의 없는 리포좀입니다. 그러나, 비-네이티브(non-native) 형태로의 가짜 접힘 및/또는 로드된 단백질 사이의 무작위적인 비기능적 상호작용으로 인해, 서브유닛은 종종 네이티브 및 게르만 에피토프(germane epitope)가 부족하여 면역계를 충분히 프라이밍하지 못한다14,19,20.

결과적으로, 박테리아의 세포외 소포체(EV)는 유망한 대안으로 속도를 내고 있습니다 21,22,23,24,25,26. 전형적으로, 박테리아 EV(bEV)는 핵산, 지질, 수백 개의 대사 산물 및 단백질의 일부를 포함하는 세포 구성 요소의 하위 집합을 포함합니다27,28. 몇 가지 정제된 단백질이 인위적으로 로드되는 리포솜과 달리, bEV는 특히 보조제 및 톨 유사 수용체(TLR) 작용제의 부스트/보조 없이 면역 체계를 프라이밍하는 더 나은 성향을 가진 수백 개의 자연적으로 로드되고 자연스럽게 접힌 단백질을 포함합니다27,28,29. 이러한 연구 분야에서 당사와 다른 연구자들은 BCG30에 대한 잠재적인 서브유닛 부스터로서 마이코박테리아 EV의 유용성을 탐구했습니다. bEV가 균일한 항원 부하가 부족하다는 우려에도 불구하고, 약독화된 Neisseria meningitidis의 EV는 혈청군 B 수막구균으로부터 인간을 성공적으로 보호했습니다31,32.
적어도 이론적으로는 BCG를 잘 부스트할 수 있는 최고의 EV는 병원성 박테리아가 농축된 EV입니다. 그러나 병원성 마이코박테리움에 의해 생성된 EV를 농축하는 것은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 위험합니다. 또한 병원체에서 생성된 EV는 보호 기능보다 독성이 더 강할 수 있습니다. 잠재적인 위험을 감안하여, 여기에서는 독성이 강한 마이코박테리움인 축삭 배양 Msm에 의해 생성된 EV의 농축에 대해 잘 테스트된 프로토콜을 보고합니다.
그러나, 여러 병원체 단백질 ortholog를 암호화하고 있음에도 불구하고, 독성 마이코박테리아는 면역 체계를 보호하기 위해 충분히 준비시키는 데 필요한 몇 가지 백신 항원/병원성 단백질 에피토프가 부족하다33. 따라서 분자 공학을 통해 Msm의 재조합 EV를 구성하고 농축하여 Msm에서 발현되고 번역된 관심 병원성 단백질의 상당 부분이 EV에 도달해야 하는 연구도 수행했습니다. 우리는 Msm EV의 상위 10개 풍부한 단백질 중 하나 이상이 관심 단백질에 융합될 때 이러한 전좌에 도움이 될 것이라는 가설을 세웠습니다.
실험실에서 마이코박테리아 EV(mEV)의 농축을 표준화하기 시작했을 때, 2011년 Prados-Rosales et al.은 시험관 내 mEV의 시각화 및 농축을 처음으로 보고했습니다 30. 이후 2014년에 같은 그룹이 2011년 방법34의 수정된 버전을 발표했습니다. 2015년에 Lee et al.은 또한 mycobacteria35의 액센 배양에서 mEV 농축을 위한 독립적으로 표준화된 방법을 보고했습니다. 두 프로토콜 34,35를 결합하고 철저한 표준화 후 몇 가지 수정 사항을 통합하여, 마이코박테리아36의 액센 배양으로부터 mEV를 일상적으로 농축하는 데 도움이 되는 프로토콜을 설명합니다.
여기에서, 우리는 일반적으로 마이코박테리아 EV의 농축을 위해 발표된 프로토콜36의 확장인 Msm-특이적 EV의 농축에 대해 특히 자세히 설명합니다. 또한 mCherry 단백질(적색 형광 리포터)과 Mycobacterium tuberculosis의 우세한 면역원이자 잠재적인 하위 단위 백신물질인 EsxA(Esat-6)37,38,39를 포함하는 재조합 mEV(R-mEV)를 구성하는 방법에 대해서도 자세히 설명합니다. R-mEV를 강화하기 위한 프로토콜은 Msm의 기본 EV를 강화하기 위해 설명한 프로토콜과 동일합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

마이코박테리아를 포함한 대부분의 박테리아는 세포외 소포체(EV)를 생성합니다. 박테리아 EV(bEV)에는 대사 산물, 지질, 단백질 및 핵산을 포함한 세포 구성 요소의 하위 집합이 포함되어 있기 때문에 여러 그룹에서 서브유닛 백신 후보로서의 보호 효능에 대해 bEV의 네이티브 또는 재조합 버전을 평가했습니다. 네이티브 EV와 달리 재조합 EV는 하나 이상의 관심 면역원을 포함하도록 분자 공학적으로 설계되었습니다. 지난 10년 동안 여러 그룹에서 재조합 bEV를 생성하기 위한 다양한 접근 방식을 탐구했습니다. 그러나 여기서는 마이코박테리아에서 재조합 마이코박테리아 EV(mEV)의 설계, 구성 및 농축을 보고합니다. 이를 위해 우리는 무독성 토양 마이코박테리움인 Mycobacterium smegmatis (Msm)를 모델 시스템으로 사용합니다. 먼저 Msm의 네이티브 EV의 생성과 강화에 대해 설명합니다. 그런 다음 적색 형광 리포터 단백질인 mCherry 또는 Mycobacterium tuberculosis의 저명한 면역원인 EsxA(Esat-6)를 포함하는 재조합 mEV의 설계 및 구성에 대해 설명합니다. mCherry와 EsxA N-말단을 작은 Msm 단백질 Cfp-29의 C-말단과 별도로 융합하여 이를 달성합니다. Cfp-29는 MsmEV에 풍부하게 존재하는 몇 안 되는 단백질 중 하나입니다. Msm에서 재조합 mEV를 생성하고 농축하는 프로토콜은 Msm의 네이티브 EV의 생성 및 농축과 동일하게 유지됩니다.

M. smegmatis(Msm)를 모델 마이코박테리움으로 사용하여 네이티브 및 재조합 mEV(R-mEV)의 농축을 입증합니다. 이 개략적으로 요약된 mEV 농축 프로토콜(그림 1)은 Msm의 R-mEV 및 Mtb의 네이티브 EV의 농축에도 작동합니다(1.2의 프로토콜 노트에서와 같이 약간의 수정 포함). 농축된 mEV를 시각화하려면 투과 전자 현미경(36)으로 음성으로 염색해야 합니다(<strong clas...

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Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

마이코박테리아 EV를 강화하면 내용물을 설명하고, 파벌을 해독하고, 주로 백신 후보를 활용하는 재조합 EV를 구성하고 생성하는 방법을 설계하는 데 도움이 됩니다. 6개의 계열은 박테리아 표면의 다른 위치에서 생성됩니다. 보존된 마커가 없습니다.따라서 모든 선호도 기반 접근 방식은 EV의 하위 집합만 강화할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 방법은 생성된 모든 마이코박테리아 EV를 포착합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Mohd Ilyas입니다.먼저 예열된 10H9 육수가 들어 있는 50밀리리터 원심분리 튜브에 야생형 또는 재조합 Mycobacterium smegmatis의 글리세롤 스톡 1밀리리터를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 튜브를 휘젓고 섭씨 37도에서 200-220RPM 사이의 배양액을 밤새 배양합니다. 다음날 600 나노 미터의 광학 밀도가 약 1에 도달하면 실온에서 3, 200 G에서 10 분 동안 배양 물을 원심 분리하고 상층액을 액체 폐기 용기에 버립니다.미리 예열된 Sautons 매체 1밀리리터를 추가하고 균일한 현탁액을 얻기 위해 부드럽게 재현탁합니다. Sautons 매체를 사용하여 부피를 10밀리리터로 구성하십시오. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다.세척 후 박테리아 세포를 재현탁하십시오. 20 밀리리터의 사전 데워진 Sautons 매체에 넣고 600 나노 미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 필요한 양의 박테리아 현탁액을 330 밀리리터의 Sautons 배지가 들어있는 1-2 리터의 삼각 플라스크에 접종하고 광학 밀도가 0.3에 도달 할 때까지 섭씨 37도에서 200 RPM으로 배양합니다.다음 날, 앞서 설명한 대로 세포를 한 번 세척하고 1/10 트윈 80을 포함하는 330밀리리터의 Sautons에 펠릿을 재현탁시킵니다. 셀 현탁액 50밀리리터를 1리터 플라스크 6개에 분배하고, 각 플라스크에는 1/10 트윈 80이 들어 있는 280밀리리터의 예열된 소우톤이 들어 있습니다. 섭씨 37도에서 200RPM으로 배양물을 2-2.5에 도달할 때까지 배양합니다.6개의 400 밀리리터 병에 중간 지수 단계 배양액 2리터를 추가하고 섭씨 4도에서 20분 동안 8, 000G에서 원심분리합니다. 상층액 및 사전 냉각된 오토클레이브 플라스크 또는 비커를 수집하고 분석 절차를 위해 펠릿의 부분 표본을 저장합니다. 펠릿은 EV가 mCherry에 대해 재조합 된 경우 착색되고 야생형 인 경우 갈색이거나 비 형광 단백질에 대해 재조합 된 경우 갈색입니다.0.45미크론 폐기 필터를 통해 배양 상층액을 여과한 다음 0.22미크론 필터를 통해 여과하여 박테리아의 모든 흔적을 제거합니다. 다음에, 4에 두 배 증류한 물의 15 밀리리터를 가진 30 킬로달톤 막 집중 장치를 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 G를 전 세척하십시오. 그런 다음 동일한 조건을 사용하여 사전 여과된 15ml의 차가운 Sautons 매체로 세척하여 모든 화학 물질의 흔적을 제거합니다.세척 후에, 집중 장치로 걸러진 경작한 상층액의 15 밀리리터를 추가하고 4, 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 G에 집중하십시오. 농축액을 차가운 40밀리리터의 Oak Ridge 원심분리기 튜브 또는 50밀리리터의 새 Falcon 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 2리터의 배양 여과액 전체가 농축되면 농축액을 이중 증류, 세척 및 사전 냉각된 50밀리리터 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮기고 2단계 원심분리를 실시합니다.첫째로 4, 000 G에, 그리고 그 후에 15에, 000 G.Transfer 전 식힌 38.5 밀리리터 ultracentrifuge 관으로 분리한 농축액은 100, 4 섭씨 온도에 4 시간 동안 000 G를 회전시킨다. 미리 냉각된 50밀리리터의 신선한 Falcon 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다. 초원심분리기 튜브를 보푸라기가 없는 신선한 흡수성 종이에 뒤집어 상층액의 흔적을 제거하고 펠릿을 600마이크로리터의 HEPES 완충액에 다시 현탁시킵니다.13밀리리터의 사전 냉각된 UltraClear 폴리프로필렌 초원심분리기 튜브의 바닥에 재현탁 펠릿을 겹쳐 놓고 4밀리리터의 불활성 60% 밀도 구배 요오딕산올 용액과 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 40 % 30 % 20 % 및 10 %의 요오드화 산올 각각 1 밀리리터를 오버레이합니다. 상단에 4ml의 6% 요오딕산올을 추가하여 튜브를 채웁니다.주의깊게 유리제 비커 또는 대에 있는 관의 무게를 달기 후에, 4 섭씨 온도에 141, 16 시간 동안 000 G에 ultracentrifugation를 위한 진동 물통 회전자에 그리고 그 후에 진동하는 물통 회전자에 온화하게 그것을 옮기십시오. 초원심분리 후 튜브를 조심스럽게 제거하고 1밀리리터 분획을 오토클레이브 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. TEM 분석은 마이코박테리아 EV가 원형임을 보여주었고 나노 추적 분석은 직경이 20나노미터에서 250나노미터 사이인 다양한 크기의 EV를 확인했습니다.mCherry의 N-말단 말단이 CFP-29의 C-말단 말단에 번역적으로 융합되었을 때, Msm의 농축된 mEV의 일부가 분홍색으로 변했는데, 이는 cf-29가 관심 있는 외부 단백질을 운반할 수 있는 능력을 나타냅니다. 그런 다음 CFP-29를 사용하여 Msm EV에 대한 EsxA 제공을 평가했습니다. Mtb의 EsxA는 Msm EV에서 소량으로 관찰되었습니다.CFP-29 EsxA 3X FLAG는 더 안정적이었고 mEV에서 더 높은 수준으로 축적되었습니다. 생리학적으로 다양한 조건에서 자란 마이코박테리아에서 EV를 농축하면 지속적인 감염성, 발병 기전 및 병원균 확산을 지시하는 변경된 내용물과 수정된 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

마이코 박테리아의 세미 양적, 중간 처리량 열거의 숯 한천 레사 주린 분석의 시각화

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...