Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Forfatterne takker Prof. Sarah M. Fortune for vennlig deling M. smegmatis mc2155 lager. De anerkjenner også Servier Medical Art (smart.servier.com) for å gi noen grunnleggende elementer for figur 1. De anerkjenner oppriktig støtten fra resten av laboratoriemedlemmene for deres pasientjusteringer under lang bruk av inkubatorristere, sentrifuger og ultrasentrifuger for mEV-anrikning. De anerkjenner også Mr. Surjeet Yadav, laboratorieassistenten, for alltid å sørge for at de nødvendige glassene og forbruksvarene alltid var tilgjengelige og hendige. Til slutt anerkjenner de de administrative, innkjøps- og økonomiteamene til THSTI for deres konstante støtte og hjelp i den sømløse gjennomføringen av prosjektet.

1. Vekstbetingelser for Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli og deres derivater
<ol><li>Media<ol><li>Middlebrook 7H9 flytende buljong<ol><li>Forbered 20% Tween-80 stamløsning ved å forvarme det nødvendige volumet av dobbeltdestillert vann (ddw) i et glassbeger til ~ 45-50 oC i en mikrobølgeovn, tilsett det nødvendige volumet av Tween-80 ved hjelp av en passende målesylinder, og rør kontinuerlig på en liten magnetisk omrører f...

Siden utviklingen av en ny TB-vaksine som er overlegen og kan erstatte BCG, forblir en formidabel utfordring, som et alternativ, forfølger flere grupper oppdagelsen av forskjellige subenhet TB-vaksiner som kan øke BCGs styrke og forlenge beskyttelsesvarigheten48,49. Gitt den økende oppmerksomheten mot bakterielle EV (bEV) som potensielle underenheter og som naturlige hjelpestoffer50,51, har konsekvent ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Til tross for utvikling og administrasjon av et bredt spekter av vaksiner mot smittsomme sykdommer, til og med i dag, ~ 30% av alle menneskelige dødsfall forekommer fortsatt fra smittsomme sykdommer1. Før adventen av tuberkulose (TB) vaksine - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - TB var nummer én morder (~ 10.000 til 15.000 / 100.000 befolkning)2. Med administrering av BCG og enkel tilgang til første- og andrelinje anti-TB-legemidler, innen 2022, har TB-relaterte dødsfall dramatisk falt til ~ 1 million / år innen 2022 (dvs. ~ 15-20 / 100,000 befolkning1). Men i TB-endemiske populasjoner i verden fortsetter TB-relaterte dødsfall å stå på ~ 100-550 / 100,000 befolkning1. Mens eksperter anerkjenner flere årsaker som fører til disse skjeve tallene, synes BCG-mediert beskyttelse som ikke varer selv i det første tiåret av livet, å være den fremtredende årsaken 3,4,5,6,7. Følgelig, gitt de fornyede "bærekraftige utviklingsmålene" til FN og "End TB Strategy" fra WHO, er det en samordnet global innsats for å utvikle et mye bedre vaksinealternativ til BCG som kanskje gir livslang beskyttelse mot TB.

Mot dette målet evaluerer flere grupper for tiden modifiserte/rekombinante BCG-stammer, ikke-patogene og svekkede mykobakteriearter annet enn BCG, og subenhetskandidater 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Vanligvis er subenhetsvaksiner liposomer selektivt lastet med få rensede (~ 1-6) fulllengde eller avkortede immunogene proteiner av patogenet. Men på grunn av deres falske folding i ikke-innfødte konformasjoner og / eller tilfeldige ikke-funksjonelle interaksjoner mellom de lastede proteiner, mangler underenheter ofte innfødte og germane epitoper og dermed ikke klarer å tilstrekkelig prime immunsystemet14,19,20.

Følgelig har ekstracellulære vesikler (EV) av bakterier tatt opp tempo som et lovende alternativ 21,22,23,24,25,26. Vanligvis inneholder bakterielle EVs (bEVs) en delmengde av deres cellulære komponenter, inkludert noen deler av nukleinsyrer, lipider og hundrevis av metabolitter og proteiner27,28. I motsetning til liposomer hvor noen få rensede proteiner er kunstig lastet, inneholder bEVs hundrevis av naturlig ladede, naturlig foldede proteiner med en bedre tilbøyelighet til å prime immunsystemet, spesielt uten boost/hjelp av adjuvans og Toll-lignende reseptoragonister (TLR)27,28,29. Det er i denne forskningen at vi og andre har undersøkt nytten av mykobakterielle EV som potensielle subenhetsforsterkere til BCG30. Til tross for bekymringer om at bEV mangler ensartede antigenbelastninger, har EV fra dempede Neisseria meningitidis vellykket beskyttet mennesker mot serogruppe B meningokokker31,32.
I det minste teoretisk er de beste elbilene som kan øke BCG godt, elbilene som er beriket med sykdomsfremkallende bakterier. Imidlertid er berikende elbiler generert av patogen mykobakterie dyrt, tidkrevende og risikabelt. I tillegg kan patogengenererte elbiler være mer virulente enn beskyttende. Gitt de potensielle risikoene, rapporterer vi her en velprøvd protokoll for anrikning av elbiler generert av aksenisk dyrket Msm, en avirulent mykobakterie.
Til tross for koding av flere patogenproteinortologer, mangler imidlertid avirulent mykobakterier flere vaksineantigener/patogene proteinepitoper som er nødvendige for å klargjøre immunsystemet tilstrekkelig mot beskyttelse33. Derfor utforsket vi også å konstruere og berike rekombinante EVer av Msm gjennom molekylærteknikk, slik at en betydelig del av ethvert patogent protein av interesse uttrykt og oversatt i Msm, må nå sine EVer. Vi antydet at en eller flere av de 10 rikelige proteinene i Msm EV når de smeltes sammen med proteinet av interesse, vil hjelpe til med en slik translokasjon.
Mens vi begynte å standardisere anrikningen av mykobakterielle EV (mEVs) i laboratoriet vårt, rapporterte Prados-Rosales et al. først visualisering og anrikning av mEVs in vitro30 i 2011. Senere, i 2014, publiserte den samme gruppen en modifisert versjon av sin 2011-metode34. I 2015 rapporterte Lee et al. også en uavhengig standardisert metode for mEV-anrikning igjen fra akseniske kulturer av mykobakterier35. Ved å kombinere begge protokollene 34,35 og inkorporere noen av våre modifikasjoner etter grundig standardisering, beskriver vi her en protokoll som hjelper rutinemessig å berike mEVs fra akseniske kulturer av mykobakterier36.
Her beskriver vi spesielt anrikningen av MSM-spesifikke elbiler, som er en utvidelse av en publisert protokoll36 for anrikning av mykobakterielle elbiler generelt. Vi beskriver også hvordan man konstruerer rekombinante mEVs (R-mEVs) som inneholder mCherry-proteinet (som en rød fluorescerende reporter) og EsxA (Esat-6) 37,38,39, et dominerende immunogen og et potensielt subenhetsvaksinogen av Mycobacterium tuberculosis. Protokollen for å berike R-mEV-ene forblir identisk med den vi har beskrevet for å berike innfødte elbiler fra Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

De fleste bakterier, inkludert mykobakterier, genererer ekstracellulære vesikler (EV). Siden bakterielle EVs (bEVs) inneholder en delmengde av cellulære komponenter, inkludert metabolitter, lipider, proteiner og nukleinsyrer, har flere grupper evaluert enten de opprinnelige eller rekombinante versjonene av bEVs for deres beskyttende styrke som subenhetsvaksinekandidater. I motsetning til innfødte EV-er, er rekombinante EV-er molekylært konstruert for å inneholde ett eller flere immunogener av interesse. I løpet av det siste tiåret har ulike grupper utforsket ulike tilnærminger for å generere rekombinante bEVs. Her rapporterer vi imidlertid design, konstruksjon og anrikning av rekombinante mykobakterielle EV (mEV) i mykobakterier. Mot det bruker vi Mycobacterium smegmatis (Msm), en avirulent jordmykobakterie som modellsystem. Vi beskriver først generering og berikelse av innfødte elbiler av Msm. Deretter beskriver vi design og konstruksjon av rekombinante mEVs som inneholder enten mCherry, et rødt fluorescerende reporterprotein, eller EsxA (Esat-6), et fremtredende immunogen av Mycobacterium tuberculosis. Dette oppnår vi ved å smelte sammen mCherry og EsxA N-terminalen separat med C-terminalen av et lite Msm-protein Cfp-29. Cfp-29 er et av de få rikelig tilstedeværende proteinene til MsmEVs. Protokollen for å generere og berike rekombinante mEV-er fra Msm forblir identisk med generering og anrikning av innfødte EV-er av Msm.

Vi bruker M. smegmatis (Msm) som modell mycobacterium for å demonstrere anrikning av både native og rekombinante mEVs (R-mEVs). Denne skjematisk oppsummerte mEVs berikelsesprotokoll (figur 1) fungerer også for anrikning av R-mEVs av Msm og native EVs av Mtb (med mindre modifikasjoner som i protokollnotater på 1.2). Visualisering av de berikede mEVene krever negativ farging av dem under et transmisjonselektronmikroskop36 (figur 2A</str...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Denne protokollen beskriver anrikningen av native mykobakterielle ekstracellulære vesikler (mEVs) fra akseniske kulturer av Mycobacterium smegmatis (Msm) og hvordan mCherry (en rød fluorescerende reporter) som inneholder rekombinante MsmEVs kan utformes og berikes. Til slutt verifiserer den den nye tilnærmingen med anrikning av MsmEVs som inneholder EsxA-proteinet av Mycobacterium tuberculosis.

Anrikning av innfødte og rekombinante ekstracellulære vesikler av mykobakterier

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Berikende mykobakterielle elbiler bidrar til å avgrense innholdet, dechiffrere fraksjonene og datoene for å konstruere og generere rekombinante elbiler som hovedsakelig utnytter vaksinekandidater. Seks serier genererer fra forskjellige steder av bakterieoverflaten. De har ikke konserverte markører.Derfor kan alle affinitetsbaserte tilnærminger bare berike en delmengde av elbilene. Derimot fanger metoden vår opp alle genererte mykobakterielbiler. Demonstrere prosedyren vil være Mohd Ilyas, en PhD-student fra laboratoriet mitt.For å begynne, tilsett en milliliter glyserolbestand av villtype eller rekombinant Mycobacterium smegmatis til et 50 milliliter sentrifugerør inneholdende 10 ml forvarmet 7H9-buljong. Lukk lokket og virvle røret før du ruger kulturen over natten ved 37 grader Celsius mellom 200 og 220 RPM. Neste dag, når den optiske tettheten ved 600 nanometer når omtrent en, sentrifugerer kulturen ved 3.200 G i 10 minutter ved romtemperatur og kaster supernatanten i en flytende kassebeholder.Tilsett en milliliter forvarmede Sautons media og heng forsiktig opp igjen for å oppnå en jevn suspensjon. Gjør opp volumet til 10 milliliter ved hjelp av Sautons media. Sentrifuge igjen og kast supernatanten.Etter vask, resuspender bakteriecellene. i 20 milliliter forvarmede Sautons media og måle den optiske tettheten ved 600 nanometer. Inokuler det nødvendige volumet av bakteriell suspensjon i en til to liters Erlenmeyer-kolbe inneholdende 330 ml Sautons media og inkuber ved 37 grader Celsius i 200 RPM til den optiske tettheten når 0,3.Neste dag, vask cellene en gang som tidligere demonstrert og resuspender pelleten i 330 ml Sautons inneholdende 1/10 Tween 80. Fordel 50 ml av cellesuspensjonen i seks en-liters kolber, som hver inneholder 280 ml forvarmede Sautons som inneholder 1/10 Tween 80. Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius i 200 RPM til den optiske tettheten når to til 2, 5.Tilsett to liter mellomeksponentielle scenekulturer til seks 400 milliliter flasker og sentrifuge ved 8.000 g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Samle supernatant og forkjølte autoklaverte kolber eller beger og lagre en aliquot av pelleten for analytiske prosedyrer. Pelleten er farget hvis elbilene er rekombinante for mCherry og brune hvis de er villtype eller rekombinant for ikke-fluorescerende proteiner.Filtrer kultursupernatanten gjennom et 0,45-mikron avhendingsfilter, etterfulgt av filtrering gjennom et 0,22-mikron filter for å fjerne alle spor av bakterier. Deretter forvasker du 30 kilodalton membrankonsentratorene med 15 ml dobbeltdestillert vann ved 4.000 g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Vask deretter med 15 ml forfiltrerte kalde Sautons media med de samme forholdene for å fjerne alle spor av kjemikalier.Etter vask, tilsett 15 ml filtrert dyrket supernatant i en konsentrator og konsentrer ved 4.000 g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Overfør konsentratet til et kaldt 40 milliliter Oak Ridge-sentrifugerør eller et 50 milliliter ferskt Falcon-sentrifugerør. Når hele to liter kulturfiltrat er konsentrert, overfør konsentratet til et dobbeltdestillert, vasket og forkjølt 50 milliliter polypropylensentrifugerør og utsatt for en to-trinns sentrifugering.Først ved 4.000 G, og deretter ved 15.000 G.Overfør sentrifugert konsentrat til et forkjølt 38, 5 milliliter ultracentrifugerør og spinn ved 100 000 G i fire timer ved fire grader Celsius. Samle supernatanten i et forkjølt 50 milliliter ferskt Falcon-sentrifugerør. snu ultrasentrifugerøret på et friskt, lofritt absorberende papir for å fjerne spor av supernatanten og resuspendere pelleten i 600 mikroliter HEPES-buffer.Legg den resuspenderte pelleten lagvis i bunnen av et 13 milliliter forkjølt UltraClear polypropylen ultrasentrifugerør og bland forsiktig med fire milliliter inert 60 % tetthet gradient jodixanolløsning. Deretter overlegg med en milliliter hver på 40% 30% 20% og 10% av jodixanol. Fyll røret ved å tilsette fire milliliter 6% iodixanol øverst.Etter å ha veid røret forsiktig i et glassbeger eller et stativ, overfør det forsiktig til de svingende skuffene og deretter til den svingende skuffrotoren for ultracentrifugering ved 141 000 G i 16 timer ved fire grader Celsius. Etter ultrasentrifugering, fjern forsiktig røret og samle en milliliter fraksjon i autoklaverte mikrosentrifugerør. TEM-analyser viste at en mykobakteriell elbil er sirkulær, og nanosporingsanalyser bekreftet elbiler i forskjellige størrelser med diametere mellom 20 og 250 nanometer.Når den N-terminale enden av mCherry ble translasjonelt smeltet til den C-terminale enden av CFP-29, ble en del av berikede mEVs av Msm rosa, noe som indikerer cf-29s evne til å bære et fremmed protein av interesse. CFP-29 ble deretter brukt til å evaluere EsxA-levering til Msm EV. Mtbs EsxA ble observert i MSM EV i lave mengder.CFP-29 EsxA 3X FLAG var mer stabil og akkumulerte på høyere nivåer i mEV. Berikelse av elbiler fra mykobakterier dyrket under fysiologiske forskjellige forhold gir innsikt i deres endrede innhold og modifiserte funksjoner som dikterer vedvarende smittsomhet, patogenese og patogenspredning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produksjon og Titering av rekombinant Adeno-assosiert virale vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redning av rekombinant Newcastle Disease Virus fra cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualisering av Charcoal Agar Resazurin analyse for Semi-kvantitativ, Medium-throughput telling av mykobakterier

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry å analysere Antigen Spectra av Virioner og ekstracellulære vesikler

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering og karakterisering av ekstracellulære blemmer fra voksen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolering av ekstracellulære blemmer fra Murine Bronchoalveolar Lavage – bruk en ultrafiltrasjon sentrifugering teknikk

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generasjon, forsterkning og titrering rekombinant respiratorisk Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...