Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
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Os autores agradecem sinceramente à Prof. Sarah M. Fortune por gentilmente compartilhar M. smegmatis mc2155 ações. Eles também reconhecem a Servier Medical Art (smart.servier.com) por fornecer alguns elementos básicos para a Figura 1. Eles reconhecem sinceramente o apoio do resto dos membros do laboratório para seus ajustes de pacientes durante o longo uso dos agitadores da incubadora, centrífugas e ultracentrífugas para enriquecimento de mEV. Eles também reconhecem o Sr. Surjeet Yadav, o assistente de laboratório, por sempre garantir que os utensílios de vidro e consumíveis necessários estivessem sempre disponíveis e à mão. Por fim, eles agradecem às equipes administrativa, de compras e financeiras da THSTI por seu constante apoio e ajuda na execução perfeita do projeto.

1. Condições de crescimento de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli e seus derivados
<ol><li>Mídia<ol><li>Caldo líquido Middlebrook 7H9<ol><li>Prepare a solução-estoque de Tween-80 a 20% pré-aquecendo o volume necessário de água bidestilada (ddw) em um copo de vidro a ~45-50 o C em um micro-ondas, adicione o volume necessário de Tween-80 usando um cilindro de medição apropriado e mexa continuamente em um pequeno agitador magnético pa...

Uma vez que o desenvolvimento de uma nova vacina contra TB que seja superior e possa substituir a BCG continua sendo um desafio formidável, como alternativa, vários grupos estão buscando a descoberta de diferentes vacinas contra TB de subunidades que possam aumentar a potência da BCG e estender sua duração protetora48,49. Dada a crescente atenção aos EVs bacterianos (bEVs) como subunidades potenciais e como adjuvantes naturais50,51...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Apesar do desenvolvimento e administração de uma ampla gama de vacinas contra doenças infecciosas, até hoje, ~30% de todas as mortes humanas ainda ocorrem por doenças transmissíveis1. Antes do advento da vacina contra a tuberculose (TB) - Bacilo Calmette Guerin (BCG) - a TB era a principal causa de morte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)2. Com a administração de BCG e o fácil acesso a medicamentos anti-TB de primeira e segunda linha, em 2022, as mortes relacionadas à TB caíram drasticamente para ~1 milhão/ano em 2022 (ou seja, ~15-20/100.000 habitantes1). No entanto, em populações endêmicas de TB do mundo, as mortes relacionadas à TB continuam a ser de ~100-550/100.000 habitantes1. Embora os especialistas reconheçam várias razões que levam a esses números distorcidos, a proteção mediada por BCG que não dura nem mesmo a primeira década de vida parece ser a razão proeminente 3,4,5,6,7. Consequentemente, dados os renovados "Objetivos de Desenvolvimento Sustentável" da ONU e a "Estratégia para Acabar com a TB", da OMS, há um esforço global concertado para desenvolver uma alternativa vacinal muito superior à BCG que talvez forneça proteção vitalícia contra a TB.

Com esse objetivo, vários grupos estão atualmente avaliando cepas de BCG modificadas/recombinantes, espécies de micobactérias não patogênicas e atenuadas que não a BCG e candidatas a subunidades 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Normalmente, as vacinas de subunidades são lipossomas seletivamente carregadas com poucas proteínas imunogênicas purificadas (~1-6) completas ou truncadas do patógeno. No entanto, devido ao seu enovelamento espúrio em conformações não-nativas e/ou interações aleatórias não funcionais entre as proteínas carregadas, as subunidades frequentemente carecem de epítopos nativos e alemães e, portanto, não conseguem preparar suficientemente o sistema imune14,19,20.

Consequentemente, vesículas extracelulares (EVs) de bactérias têm ganhado ritmo como uma alternativa promissora21,22,23,24,25,26. Tipicamente, os EVs bacterianos (bEVs) contêm um subconjunto de seus componentes celulares, incluindo algumas porções de ácidos nucléicos, lipídios e centenas de metabólitos e proteínas27,28. Ao contrário dos lipossomas, onde algumas proteínas purificadas são carregadas artificialmente, os bEVs contêm centenas de proteínas naturalmente carregadas, dobradas nativamente, com maior propensão a estimular o sistema imunológico, especialmente sem o impulso/auxílio de adjuvantes e agonistas do receptor Toll-like (TLR)27,28,29. É nessa linha de pesquisa que nós e outros exploramos a utilidade dos EVs micobacterianos como potenciais impulsionadores de subunidades para BCG30. Apesar das preocupações de que os bEVs não possuem cargas antigênicas uniformes, EVs de Neisseria meningitidis atenuada têm protegido com sucesso os humanos contra o meningococo do sorogrupo B31,32.
Pelo menos teoricamente, os melhores EVs que poderiam impulsionar bem o BCG são os EVs enriquecidos a partir de bactérias patogênicas. No entanto, o enriquecimento de EVs gerados por micobactérias patogênicas é caro, demorado e arriscado. Além disso, os EVs gerados por patógenos podem ser mais virulentos do que protetores. Diante dos riscos potenciais, relatamos aqui um protocolo bem testado para o enriquecimento de EVs gerados por Msm, uma micobactéria avirulenta cultivada axenicamente.
No entanto, apesar de codificarem vários ortólogos de proteínas patogênicas, as micobactérias avirulentas carecem de vários antígenos vacinais/epítopos proteicos patogênicos necessários para preparar suficientemente o sistema imune em direção à proteção33. Portanto, também exploramos a construção e o enriquecimento de EVs recombinantes de Msm por meio de engenharia molecular, de modo que uma parcela significativa de qualquer proteína patogênica de interesse expressa e traduzida em Msm, deve atingir seus EVs. Nós hipotetizamos que uma ou mais das 10 principais proteínas abundantes de Msm EVs, quando fundidas à proteína de interesse, ajudarão nessa translocação.
Enquanto estávamos começando a padronizar o enriquecimento de EVs micobacterianos (mEVs) em nosso laboratório, em 2011, Prados-Rosales et al., pela primeira vez, relataram a visualização e o enriquecimento de mEVs in vitro30. Posteriormente, em 2014, o mesmo grupo publicou uma versão modificada de seu método de 201134. Em 2015, Lee e col. também relataram um método padronizado independentemente para enriquecimento de mEV novamente a partir de culturas axênicas de micobactérias35. Combinando ambos os protocolos34,35 e incorporando algumas de nossas modificações após padronização completa, descrevemos aqui um protocolo que ajuda a enriquecer rotineiramente mEVs de culturas axênicas de micobactérias36.
Aqui, detalhamos particularmente o enriquecimento de EVs Msm-específicos, que é uma extensão de um protocolo publicado36 para o enriquecimento de EVs micobacterianos em geral. Também detalhamos como construir mEVs recombinantes (R-mEVs) que contêm a proteína mCherry (como um repórter fluorescente vermelho) e EsxA (Esat-6)37,38,39, um imunógeno predominante e uma potencial subunidade vacinal do Mycobacterium tuberculosis. O protocolo para o enriquecimento dos R-mEVs permanece idêntico ao que descrevemos para o enriquecimento dos EVs nativos de Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

A maioria das bactérias, incluindo as micobactérias, gera vesículas extracelulares (EVs). Uma vez que os EVs bacterianos (bEVs) contêm um subconjunto de componentes celulares, incluindo metabólitos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, vários grupos avaliaram as versões nativas ou recombinantes de bEVs por sua potência protetora como candidatos a vacinas de subunidades. Ao contrário dos EVs nativos, os EVs recombinantes são projetados molecularmente para conter um ou mais imunógenos de interesse. Na última década, diferentes grupos têm explorado diversas abordagens para a geração de bEVs recombinantes. No entanto, aqui relatamos o projeto, construção e enriquecimento de EVs micobacterianos recombinantes (mEVs) em micobactérias. Para tanto, utilizamos como sistema modelo o Mycobacterium smegmatis (Msm), uma micobactéria avirulenta do solo. Primeiramente descrevemos a geração e o enriquecimento de EVs nativos de Msm. Em seguida, descrevemos o projeto e a construção de mEVs recombinantes que contêm mCherry, uma proteína repórter fluorescente vermelha, ou EsxA (Esat-6), um imunógeno proeminente do Mycobacterium tuberculosis. Conseguimos isso fundindo separadamente mCherry e EsxA N-termini com o término C de uma pequena proteína Msm Cfp-29. Cfp-29 é uma das poucas proteínas abundantemente presentes de MsmEVs. O protocolo para gerar e enriquecer mEVs recombinantes a partir de Msm permanece idêntico à geração e enriquecimento de EVs nativos de Msm.

Usamos M. smegmatis (Msm) como micobactéria modelo para demonstrar o enriquecimento de mEVs nativos e recombinantes (R-mEVs). Este protocolo de enriquecimento de mEVs esquematicamente resumido (Figura 1) também funciona para o enriquecimento de R-mEVs de Msm e EVs nativos de Mtb (com pequenas modificações como nas notas de protocolo de 1.2). A visualização dos mEVs enriquecidos requer coloração negativa em microscópio eletrônico de transmissão36 (<...

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Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

O enriquecimento de EVs micobacterianos ajuda a delinear seu conteúdo, decifrar suas facções e datar o projeto de maneiras de construir e gerar EVs recombinantes que exploram principalmente candidatos a vacinas. Seis séries são geradas a partir de diferentes locais da superfície bacteriana. Não possuem marcadores conservados.Assim, qualquer abordagem baseada em afinidade pode enriquecer apenas um subconjunto dos EVs. Em contraste, nosso método captura todas as EVs micobacterianas geradas. Quem demonstrará o procedimento será Mohd Ilyas, aluno de doutorado do meu laboratório.Para começar, adicione um mililitro de glicerol de Mycobacterium smegmatis selvagem ou recombinante a um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 10 mililitros de caldo 7H9 pré-aquecido. Feche a tampa e gire o tubo antes de incubar a cultura durante a noite a 37 graus Celsius entre 200 e 220 RPM. No dia seguinte, quando a densidade óptica de 600 nanômetros atingir aproximadamente um, centrifugar a cultura a 3.200 G por 10 minutos à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante em um recipiente de descarte líquido.Adicione um mililitro de meio Sautons pré-aquecido e ressuspenda suavemente para obter uma suspensão uniforme. Completar o volume para 10 mililitros usando meios Sautons. Centrifugar novamente e descartar o sobrenadante.Após a lavagem, ressuspenda as células bacterianas. em 20 mililitros de meios Sautons pré-aquecidos e medir a densidade óptica a 600 nanômetros. Inocular o volume necessário de suspensão bacteriana num balão de Erlenmeyer de um a dois litros contendo 330 mililitros de meios Sautons e incubar a 37 graus Celsius em 200 RPM até que a densidade óptica atinja 0,3.No dia seguinte, lave as células uma vez como demonstrado anteriormente e ressuspenda o pellet em 330 mililitros de Sautons contendo 1/10 Tween 80. Distribuir 50 mililitros da suspensão celular em seis frascos de um litro, cada um contendo 280 mililitros de Sautons pré-aquecidos contendo 1/10 Tween 80. Incubar as culturas a 37 graus Celsius em 200 RPM até que a densidade óptica atinja dois a 2,5.Adicione dois litros de culturas de estágio médio exponencial a seis garrafas de 400 mililitros e centrífuga a 8.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Recolher o sobrenadante e os frascos autoclavados ou béqueres pré-refrigerados e armazenar uma alíquota do pellet para procedimentos analíticos. O pellet é colorido se os EVs forem recombinantes para mCherry e marrom se forem selvagens ou recombinantes para proteínas não fluorescentes.Filtrar o sobrenadante da cultura através de um filtro de eliminação de 0,45 mícron, seguido de filtração através de um filtro de 0,22 mícron para remover todos os vestígios de bactérias. Em seguida, pré-lave os concentradores de membrana de 30 quilodalton com 15 mililitros de água bidestilada a 4.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave com 15 mililitros de meios Sautons frios pré-filtrados usando as mesmas condições para remover todos os vestígios de produtos químicos.Após a lavagem, adicione 15 mililitros de sobrenadante cultivado filtrado em um concentrador e concentre a 4.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o concentrado para um tubo de centrífuga Oak Ridge frio de 40 mililitros ou um tubo de centrífuga Falcon fresco de 50 mililitros. Uma vez concentrados os dois litros inteiros do filtrado de cultura, transfira o concentrado para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros bidestilado, lavado e pré-resfriado e submetido a uma centrifugação em duas etapas.Primeiro a 4.000 G, e depois a 15.000 G.Transfira o concentrado centrifugado para um tubo de ultracentrífuga pré-resfriado de 38,5 mililitros e gire a 100.000 G por quatro horas a quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante num tubo de centrifugação Falcon fresco pré-refrigerado de 50 mililitros. inverter o tubo ultracentrífugo em um papel absorvente fresco e sem fiapos para remover vestígios do sobrenadante e ressuspender o pellet em 600 microlitros de tampão HEPES.Coloque o pellet ressuspendido no fundo de um tubo ultracentrífugo de polipropileno UltraClear pré-resfriado de 13 mililitros e misture suavemente com quatro mililitros de solução inerte de iodixanol com gradiente de densidade de 60%. Em seguida, sobreponha com um mililitro cada de 40%30%20% e 10% de iodixanol. Encha o tubo adicionando quatro mililitros de iodixanol a 6% na parte superior.Depois de pesar cuidadosamente o tubo em um copo de vidro ou um suporte, transfira-o suavemente para os baldes oscilantes e, em seguida, para o rotor de caçambas oscilantes para ultracentrifugação a 141.000 G por 16 horas a quatro graus Celsius. Após a ultracentrifugação, remova cuidadosamente o tubo e colete uma fração de um mililitro em tubos de microcentrífuga autoclavados. A análise de MET mostrou que os EVs micobacterianos são circulares e a análise de nano-tracking confirmou EVs de diferentes tamanhos com diâmetros variando entre 20 e 250 nanômetros.Quando a extremidade N-terminal do mCherry foi translacionalmente fundida à extremidade C-terminal do CFP-29, uma porção dos mEVs enriquecidos de Msm tornou-se rosa, indicando a capacidade do cf-29 de transportar uma proteína estranha de interesse. CFP-29 foi então usado para avaliar a liberação de EsxA em EVs MSM. A EsxA de Mtb foi observada em EVs Msm em baixas quantidades.CFP-29 EsxA 3X FLAG foi mais estável e acumulou em níveis mais elevados em mEVs. O enriquecimento dos EVs a partir de micobactérias cultivadas sob diferentes condições fisiológicas fornece informações sobre seu conteúdo alterado e funções modificadas que ditam a infectividade sustentada, a patogênese e a disseminação do patógeno.

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