Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Авторы искренне благодарят профессора Сару М. Форчун (Sarah M. Fortune) за любезное предоставление материала M. smegmatis mc2155. Они также выражают признательность компании «Сервье Медикал Арт» (smart.servier.com) за предоставление некоторых основных элементов для рисунка 1. Они искренне признательны остальным сотрудникам лаборатории за поддержку их пациентов во время длительного использования шейкеров инкубатора, центрифуг и ультрацентрифуг для обогащения mEV. Они также выражают признательность г-ну Сурджиту Ядаву, лаборанту, за то, что он всегда следил за тем, чтобы необходимая стеклянная посуда и расходные материалы всегда были под рукой. Наконец, они выражают признательность административной, закупочной и финансовой командам THSTI за их постоянную поддержку и помощь в бесперебойной реализации проекта.

1. Условия произрастания Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli и их производных
<ol><li>Медиа<ol><li>Миддлбрук 7H9 жидкий бульон<ol><li>Приготовьте 20% исходный раствор Tween-80, предварительно нагрев необходимый объем воды двойной дистилляции (ddw) в стеклянном стакане до ~45-50 ...

Поскольку разработка новой противотуберкулезной вакцины, превосходящей БЦЖ и способной заменить ее, остается серьезной проблемой в качестве альтернативы, несколько групп работают над открытием различных субъединичных противотуберкулезных вакцин, которые могут повысить эффективно?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Несмотря на разработку и применение широкого спектра вакцин против инфекционных болезней, даже по сей день ~30% всех случаев смерти людей по-прежнему происходит от инфекционныхболезней1. До появления вакцины против туберкулеза (ТБ) - Bacillus Calmette Guerin (БЦЖ) - туберкулез был убийцей номер один (от ~10 000 до 15 000 на 100 000 населения)2. Благодаря введению БЦЖ и легкому доступу к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии к 2022 г. смертность, связанная с туберкулезом, резко снизилась до ~1 млн/год к 2022 г. (т.е. ~15-20 на 100 000населения1). Тем не менее, в эндемичных по туберкулезу популяциях мира смертность, связанная с туберкулезом, по-прежнему составляет ~100-550 на 100 000населения1. В то время как эксперты признают несколько причин, приводящих к таким искаженным цифрам, опосредованная БЦЖ защита, не сохраняющаяся даже в течение первого десятилетия жизни, по-видимому, является основной причиной 3,4,5,6,7. Таким образом, с учетом обновленных «Целей в области устойчивого развития» ООН и «Стратегии ВОЗ по ликвидации туберкулеза» предпринимаются согласованные глобальные усилия по разработке гораздо более совершенной альтернативы БЦЖ, которая, возможно, обеспечит пожизненную защиту от туберкулеза.

Для достижения этой цели несколько групп в настоящее время оценивают модифицированные/рекомбинантные штаммы БЦЖ, непатогенные и аттенуированные виды микобактерий, отличные от БЦЖ, и субъединичные кандидаты 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Как правило, субъединичные вакцины представляют собой липосомы, селективно нагруженные небольшим количеством очищенных (~1-6) полноразмерных или укороченных иммуногенных белков патогена. Тем не менее, из-за их ложного сворачивания в ненативные конформации и/или случайных нефункциональных взаимодействий между загруженными белками, субъединицы часто не имеют нативных и германных эпитопов и, следовательно, не могут в достаточной степени подготовить иммунную систему14,19,20.

Следовательно, внеклеточные везикулы (ВВ) бактерий набрали обороты в качестве многообещающей альтернативы 21,22,23,24,25,26. Как правило, бактериальные ВВ (бВВ) содержат подмножество своих клеточных компонентов, включая некоторые части нуклеиновых кислот, липидов и сотни метаболитов и белков27,28. В отличие от липосом, в которых несколько очищенных белков искусственно загружены, бэв содержат сотни естественно загруженных, нативно свернутых белков с большей склонностью к подготовке иммунной системы, особенно без усиления/помощи адъювантов и агонистов толл-подобных рецепторов (TLR)27,28,29. Именно в рамках этого направления исследований мы и другие изучили полезность микобактериальных EV в качестве потенциальных субъединичных бустеров BCG30. Несмотря на опасения по поводу того, что у бэв отсутствует однородная антигенная нагрузка, ВВ аттенуированной Neisseria meningitidis успешно защищают людей от менингококка серогруппы В31,32.
По крайней мере, теоретически, лучшими ВВ, которые могут хорошо повысить БЦЖ, являются ВВ, обогащенные патогенными бактериями. Однако обогащение электромобилей, генерируемых патогенными микобактериями, является дорогостоящим, трудоемким и рискованным процессом. Кроме того, электромобили, генерируемые патогенами, могут быть более вирулентными, чем защитными. Учитывая потенциальные риски, здесь мы сообщаем о хорошо протестированном протоколе обогащения электромобилей, генерируемых аксенически выращенной МСМ, авирулентной микобактерией.
Однако, несмотря на то, что авирулентные микобактерии кодируют несколько ортологов патогенных белков, им не хватает нескольких вакцинных антигенов/эпитопов патогенных белков, необходимых для того, чтобы в достаточной степени подготовить иммунную системук защите. Поэтому мы также исследовали создание и обогащение рекомбинантных ВВ МСМ с помощью молекулярной инженерии, таким образом, чтобы значительная часть любого патогенного белка, представляющего интерес, экспрессируемого и транслируемого в МСМ, должна достигать своих ВВ. Мы предположили, что один или несколько из 10 наиболее распространенных белков МСМ ВВ при слиянии с интересующим белком будут способствовать такой транслокации.
В 2011 году, когда мы начали стандартизировать обогащение микобактериальных ВВ (мВВ) в нашей лаборатории, Прадос-Росалес и др. впервые сообщили о визуализации и обогащении МЭВ in vitro30. Позже, в 2014 году, та же группа опубликовала модифицированную версию своего метода34 2011 года. В 2015 году Lee et al. также сообщили о независимом стандартизированном методе обогащения mEV из аксенических культур микобактерий35. Объединив оба протокола 34,35 и включив некоторые из наших модификаций после тщательной стандартизации, мы описываем здесь протокол, который помогает регулярно обогащать mEV из аксенических культур микобактерий36.
Здесь мы особенно подробно остановимся на обогащении ВВ, специфичных для МСМ, которое является расширением опубликованного протокола36 для обогащения ВВ микобактерий в целом. Мы также подробно описываем, как конструировать рекомбинантные mEV (R-mEV), которые содержат белок mCherry (в виде красного флуоресцентного репортера) и EsxA (Esat-6)37,38,39, преобладающий иммуноген и потенциальный субъединица вакциногена Mycobacterium tuberculosis. Протокол обогащения R-mEV остается идентичным тому, который мы описали для обогащения нативных электромобилей от Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

Большинство бактерий, включая микобактерии, продуцируют внеклеточные везикулы (ВВ). Поскольку бактериальные ВВ (бВВ) содержат подмножество клеточных компонентов, включая метаболиты, липиды, белки и нуклеиновые кислоты, несколько групп оценили либо нативные, либо рекомбинантные версии ВВ на предмет их защитной активности в качестве субъединичных вакцин-кандидатов. В отличие от нативных ВВ, рекомбинантные ВВ имеют молекулярную инженерию, содержащую один или несколько интересующих иммуногенов. За последнее десятилетие различные группы исследовали различные подходы к созданию рекомбинантных электромобилей. Однако здесь мы сообщаем о разработке, конструировании и обогащении рекомбинантных микобактериальных ВВ (мВВ) в микобактериях. Для этого в качестве модельной системы мы используем Mycobacterium smegmatis (Msm), авирулентную почвенную микобактерию. Сначала мы опишем генерацию и обогащение нативных электромобилей Msm. Затем мы описываем дизайн и конструкцию рекомбинантных mEV, которые содержат либо mCherry, красный флуоресцентный репортерный белок, либо EsxA (Esat-6), известный иммуноген Mycobacterium tuberculosis. Мы достигаем этого путем раздельного слияния mCherry и EsxA N-концов с С-концом небольшого белка Msm Cfp-29. Cfp-29 является одним из немногих белков, присутствующих в изобилии в MsmEV. Протокол генерации и обогащения рекомбинантных mEV из Msm остается идентичным протоколу генерации и обогащения нативных EV Msm.

Мы используем M. smegmatis (Msm) в качестве модельной микобактерии, чтобы продемонстрировать обогащение как нативных, так и рекомбинантных mEV (R-mEV). Этот схематически обобщенный протокол обогащения mEVs (рис. 1) также работает для обогащения R-mEV Msm и собственных EV Mtb (с незначительными изменени?...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

В этом протоколе подробно описывается обогащение нативных микобактериальных внеклеточных везикул (mEV) из аксенических культур Mycobacterium smegmatis (Msm) и то, как можно спроектировать и обогатить mCherry (красный флуоресцентный репортер), содержащие рекомбинантные MsmEV. Наконец, он подтверждает новый подход с обогащением MsmEV, содержащих белок EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Обогащение нативных и рекомбинантных внеклеточных везикул микобактерий

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Обогащение микобактериальных ВВ помогает определить их содержимое, расшифровать их фракции и даты, разрабатывая способы конструирования и создания рекомбинантных ВВ, которые в основном используют вакцины-кандидаты. Шесть серий генерируются из разных мест бактериальной поверхности. У них нет законсервированных маркеров.Следовательно, любые подходы, основанные на сходстве, могут обогатить только подмножество EV. В отличие от этого, наш метод захватывает все сгенерированные микобактерии ВВ. Процедуру будет демонстрировать Мохд Ильяс, аспирант из моей лаборатории.Для начала добавьте один миллилитр глицеринового бульона дикого типа или рекомбинантной Mycobacterium smegmatis в 50-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую 10 миллилитров предварительно подогретого бульона 7H9. Закройте крышку и покрутите пробирку, прежде чем инкубировать культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия при 200-220 оборотах в минуту. На следующий день, когда оптическая плотность при 600 нм достигнет примерно единицы, центрифугируют культуру при 3,200 G в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают надосадочную жидкость в емкость для сброса жидкости.Добавьте один миллилитр предварительно подогретого фильтрующего материала Sautons и аккуратно ресуспендируйте до получения однородной суспензии. Доведите объем до 10 миллилитров с помощью фильтрующего средства Sautons. Снова центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.После промывки повторно суспендируйте бактериальные клетки. в 20 миллилитрах предварительно нагретой среды Sautons и измерить оптическую плотность на 600 нанометров. Засейте необходимый объем бактериальной суспензии в одно-двухлитровую колбу Эрленмейера, содержащую 330 миллилитров среды Sautons, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия при 200 об/мин до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет 0,3.На следующий день промойте клетки один раз, как показано ранее, и повторно суспендируйте гранулы в 330 миллилитрах сотонов, содержащих 1/10 Tween 80. Распределите 50 миллилитров клеточной суспензии по шести литровым колбам, каждая из которых содержит 280 миллилитров предварительно подогретых сотонов, содержащих 1/10 Tween 80. Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия при 200 оборотах в минуту до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет от 2 до 2,5.Добавьте два литра культур средней экспоненциальной стадии в шесть бутылок по 400 миллилитров и центрифугируйте при 8 000 G в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Соберите надосадочную жидкость и предварительно охлажденные автоклавные колбы или стаканы и храните аликвоту гранул для аналитических процедур. Гранула окрашена, если EV рекомбинантны для mCherry, и коричневой, если они дикого типа, или рекомбинантной для нефлуоресцентных белков.Отфильтруйте культуру надосадочной жидкости через фильтр для утилизации 0,45 микрона, а затем фильтруйте через фильтр 0,22 микрона, чтобы удалить все следы бактерий. Затем предварительно промойте 30-килодальтонные мембранные концентраторы 15 миллилитрами воды двойной дистилляции при 4 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Затем промойте 15 миллилитрами предварительно отфильтрованного холодного носителя Sautons в тех же условиях, чтобы удалить все следы химикатов.После промывки добавьте в концентратор 15 миллилитров отфильтрованной надосадочной жидкости и концентрируйте при 4 000 г в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Перелейте концентрат в холодную 40-миллилитровую центрифужную пробирку Oak Ridge или 50-миллилитровую свежую центрифужную пробирку Falcon. После того, как все два литра фильтрата культуры будут концентрированы, переложите концентрат в 50-миллилитровую полипропиленовую центрифужную пробирку с двойной дистилляцией, промытую и предварительно охлажденную и подвергнутую двухступенчатому центрифугированию.Сначала при 4 000 Г, а затем при 15 000 Г. Центрифугированный концентрат переложить в предварительно охлажденную ультрацентрифужную пробирку объемом 38,5 миллилитра и отжимать при 100 000 G в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную 50-миллилитровую свежую центрифужную пробирку Falcon. Переверните пробирку ультрацентрифуги на свежую безворсовую впитывающую бумагу, чтобы удалить следы надосадочной жидкости и повторно суспендировать гранулу в 600 микролитрах буфера HEPES.Выложите ресуспендированную гранулу на дно 13-миллилитровой предварительно охлажденной полипропиленовой ультрацентрифужной пробирки UltraClear и осторожно смешайте с четырьмя миллилитрами инертного раствора йодиксанола с градиентом плотности 60%. Затем наложите по одному миллилитру по 40%, 30%, 20% и 10% йодиксанола. Наполните тюбик, добавив сверху четыре миллилитра 6%-ного йодиксанола.После тщательного взвешивания пробирки в стеклянном стакане или подставке осторожно переложите ее в качающиеся ведра, а затем в ротор качающихся ведер для ультрацентрифугирования при 141 000 G в течение 16 часов при четырех градусах Цельсия. После ультрацентрифугирования осторожно извлеките пробирку и соберите фракцию в один миллилитр в автоклавные микроцентрифужные пробирки. Анализ ПЭМ показал, что ВВ микобактерий имеют круглую форму, а анализ нанослежения подтвердил, что ВВ разных размеров имеют диаметр от 20 до 250 нанометров.Когда N-концевой конец mCherry был трансляционно слит с С-концевым концом CFP-29, часть обогащенных mEV Msm стала розовой, что указывает на способность cf-29 переносить интересующий нас чужеродный белок. Затем CFP-29 был использован для оценки доставки EsxA в электромобили MSM. EsxA от Mtb наблюдался в электромобилях Msm в небольших количествах.CFP-29 EsxA 3X FLAG был более стабилен и накапливался на более высоких уровнях в мEV. Обогащение ВВ микобактериями, выращенными в физиологически различных условиях, дает представление об их измененном составе и измененных функциях, которые определяют устойчивую инфекционность, патогенез и распространение патогенов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Рекомбинантный Ретровирусные Производство и Заражение В-клетки

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Производство и Titering рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Пептиды: MHC тетрамеров на основе обогащения эпитопов Т-клеток

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Визуализация Charcoal Agar резазурин Пробирной для полуколичественного, средне-пропускной Перечень микобактерий

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Поток Virometry для анализа антигенные спектры вирионов и внеклеточной везикул

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Изоляция и характеристика внеклеточного везикулы от взрослых Schistosoma японский

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Изоляция внеклеточного Vesicles из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости методом центрифугирования ультрафильтрации

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Поколение, усилители и титрование рекомбинантных респираторных вирусов-синцитиальный

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...