Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Los autores agradecen sinceramente a la Prof. Sarah M. Fortune por compartir amablemente las existencias de M. smegmatis mc2155. También reconocen a Servier Medical Art (smart.servier.com) por proporcionar algunos elementos básicos para la Figura 1. Agradecen sinceramente el apoyo del resto de los miembros del laboratorio para los ajustes de sus pacientes durante el uso prolongado de los agitadores, centrífugas y ultracentrífugas de la incubadora para el enriquecimiento de mEV. También agradecen al Sr. Surjeet Yadav, el asistente de laboratorio, por asegurarse siempre de que la cristalería y los consumibles necesarios estuvieran siempre disponibles y a mano. Por último, agradecen a los equipos administrativos, de compras y financieros de THSTI por su constante apoyo y ayuda en la ejecución sin problemas del proyecto.

1. Condiciones de crecimiento de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli y sus derivados
<ol><li>Medio<ol><li>Caldo líquido Middlebrook 7H9<ol><li>Prepare una solución madre de Tween-80 al 20 % precalentando previamente el volumen requerido de agua bidestilada (ddw) en un vaso de precipitados de vidrio a ~ 45-50 oC en un microondas, agregue el volumen requerido de Tween-80 con un cilindro de medición apropiado y revuelva continuamente ...

Dado que el desarrollo de una nueva vacuna contra la tuberculosis que sea superior a la BCG y que pueda sustituirla sigue siendo un reto formidable, como alternativa, varios grupos están buscando el descubrimiento de diferentes vacunas antituberculosas de subunidades que puedan aumentar la potencia de la BCG y prolongar su duración protectora48,49. Dada la creciente atención a las VE bacterianas (bEV) como subunidades potenciales y como adyuvantes naturales<su...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

A pesar del desarrollo y la administración de una amplia gama de vacunas contra enfermedades infecciosas, incluso hasta el día de hoy, ~ 30% de todas las muertes humanas todavía ocurren por enfermedades transmisibles1. Antes de la llegada de la vacuna contra la tuberculosis (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - la tuberculosis era la principal causa de muerte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)2. Con la administración de BCG y el fácil acceso a medicamentos antituberculosos de primera y segunda línea, para 2022, las muertes relacionadas con la tuberculosis se han reducido drásticamente a ~ 1 millón/año para 2022 (es decir, ~ 15-20/100,000 habitantes1). Sin embargo, en las poblaciones endémicas de tuberculosis del mundo, las muertes relacionadas con la tuberculosis siguen siendo de ~100-550/100.000 habitantes1. Si bien los expertos reconocen varias razones que conducen a estos números sesgados, la protección mediada por BCG que no dura ni siquiera la primera década de vida parece ser la razón principal 3,4,5,6,7. En consecuencia, dados los renovados "Objetivos de Desarrollo Sostenible" de las Naciones Unidas y la "Estrategia para poner fin a la tuberculosis" de la OMS, existe un esfuerzo mundial concertado para desarrollar una vacuna alternativa muy superior a la BCG que tal vez proporcione protección de por vida contra la tuberculosis.

Con ese objetivo, varios grupos están evaluando actualmente cepas de BCG modificadas/recombinantes, especies micobacterianas no patógenas y atenuadas distintas de BCG, y candidatos a subunidades 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por lo general, las vacunas de subunidades son liposomas cargados selectivamente con pocas proteínas inmunogénicas purificadas (~ 1-6) de longitud completa o truncadas del patógeno. Sin embargo, debido a su plegamiento espurio en conformaciones no nativas y/o interacciones aleatorias no funcionales entre las proteínas cargadas, las subunidades a menudo carecen de epítopos nativos y pertinentes y, por lo tanto, no preparan suficientemente el sistema inmune14,19,20.

En consecuencia, las vesículas extracelulares (VE) de las bacterias se han acelerado como una alternativa prometedora 21,22,23,24,25,26. Por lo general, los VE bacterianos (bEV) contienen un subconjunto de sus componentes celulares, incluidas algunas porciones de ácidos nucleicos, lípidos y cientos de metabolitos y proteínas27,28. A diferencia de los liposomas en los que unas pocas proteínas purificadas se cargan artificialmente, los bEV contienen cientos de proteínas cargadas de forma natural y plegadas de forma nativa con una mejor propensión a preparar el sistema inmunitario, especialmente sin el refuerzo/ayuda de adyuvantes y agonistas del receptor tipo Toll (TLR)27,28,29. Es en esta línea de investigación que nosotros y otros hemos explorado la utilidad de los VE micobacterianos como posibles potenciadores de subunidades para BCG30. A pesar de la preocupación de que los BVE carezcan de cargas antigénicas uniformes, los VE de Neisseria meningitidis atenuada han protegido con éxito a los seres humanos contra el meningococo del serogrupo B31,32.
Al menos teóricamente, los mejores VE que podrían impulsar bien la BCG son los VE enriquecidos a partir de bacterias patógenas. Sin embargo, el enriquecimiento de los VE generados por micobacterias patógenas es costoso, requiere mucho tiempo y es arriesgado. Además, los vehículos eléctricos generados por patógenos pueden ser más virulentos que protectores. Dados los riesgos potenciales, aquí informamos de un protocolo bien probado para el enriquecimiento de los VE generados por Msm, una micobacteria avirulenta cultivada axénicamente.
Sin embargo, a pesar de codificar varios ortólogos de proteínas patógenas, las micobacterias avirulentas carecen de varios antígenos vacunales/epítopos de proteínas patógenas necesarios para preparar suficientemente al sistema inmunitario hacia la protección33. Por lo tanto, también exploramos la construcción y el enriquecimiento de EV recombinantes de Msm a través de la ingeniería molecular, de modo que una parte significativa de cualquier proteína patógena de interés expresada y traducida en Msm, debe llegar a sus EV. Planteamos la hipótesis de que una o más de las 10 proteínas más abundantes de los EV de MSM, cuando se fusionan con la proteína de interés, ayudarán en dicha translocación.
Cuando estábamos empezando a estandarizar el enriquecimiento de las VE micobacterianas (mEVs) en nuestro laboratorio, en 2011, Prados-Rosales et al. reportaron por primera vez la visualización y enriquecimiento de las mEVs in vitro30. Más tarde, en 2014, el mismo grupo publicó una versión modificada de su método34 de 2011. En 2015, Lee et al. también informaron de un método estandarizado de forma independiente para el enriquecimiento de mEV a partir de cultivos axénicos de micobacterias35. Combinando ambos protocolos34,35 e incorporando algunas de nuestras modificaciones después de una estandarización exhaustiva, describimos aquí un protocolo que ayuda a enriquecer rutinariamente los mEV de cultivos axénicos de micobacterias 36.
Aquí, detallamos particularmente el enriquecimiento de los VE específicos de Msm, que es una extensión de un protocolo publicado36 para el enriquecimiento de los VE micobacterianos en general. También detallamos cómo construir mEVs recombinantes (R-mEVs) que contienen la proteína mCherry (como un reportero fluorescente rojo) y EsxA (Esat-6)37,38,39, un inmunógeno predominante y una potencial subunidad vaccinógena de Mycobacterium tuberculosis. El protocolo para enriquecer los R-mEVs sigue siendo idéntico al que hemos descrito para enriquecer los EVs nativos a partir de Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

La mayoría de las bacterias, incluidas las micobacterias, generan vesículas extracelulares (VE). Dado que las VE bacterianas (bEV) contienen un subconjunto de componentes celulares, incluidos metabolitos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, varios grupos han evaluado las versiones nativas o recombinantes de las bEV por su potencia protectora como candidatas a vacunas de subunidades. A diferencia de los VE nativos, los VE recombinantes están diseñados molecularmente para contener uno o más inmunógenos de interés. A lo largo de la última década, diferentes grupos han explorado diversos enfoques para generar bEVs recombinantes. Sin embargo, aquí informamos sobre el diseño, la construcción y el enriquecimiento de las VE micobacterianas recombinantes (mEV) en micobacterias. Para ello, utilizamos Mycobacterium smegmatis (Msm), una micobacteria avirulenta del suelo como sistema modelo. En primer lugar, describimos la generación y el enriquecimiento de los vehículos eléctricos nativos de MSM. A continuación, describimos el diseño y la construcción de mEVs recombinantes que contienen mCherry, una proteína reportera fluorescente roja, o EsxA (Esat-6), un inmunógeno prominente de Mycobacterium tuberculosis. Logramos esto fusionando por separado mCherry y EsxA N-terminal con el extremo C-terminal de una pequeña proteína Msm Cfp-29. Cfp-29 es una de las pocas proteínas abundantemente presentes de MsmEVs. El protocolo para generar y enriquecer mEVs recombinantes a partir de Msm sigue siendo idéntico a la generación y enriquecimiento de EVs nativos de Msm.

Utilizamos M. smegmatis (Msm) como micobacteria modelo para demostrar el enriquecimiento de mEVs nativos y recombinantes (R-mEVs). Este protocolo de enriquecimiento de mEVs resumido esquemáticamente (Figura 1) también funciona para el enriquecimiento de R-mEVs de Msm y EVs nativos de Mtb (con modificaciones menores como en las notas de protocolo de 1.2). La visualización de los mEV enriquecidos requiere teñirlos negativamente bajo un microscopio electrónico de transmisión<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

El enriquecimiento de las VE micobacterianas ayuda a delinear su contenido, descifrar sus facciones y fechas, diseñando formas de construir y generar VE recombinantes que exploten principalmente las vacunas candidatas. Seis series se generan a partir de diferentes ubicaciones de la superficie bacteriana. No tienen marcadores conservados.Por lo tanto, cualquier enfoque basado en la afinidad puede enriquecer solo un subconjunto de los EV. Por el contrario, nuestro método captura todas las VE de micobacterias generadas. El encargado de demostrar el procedimiento será Mohd Ilyas, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.Para comenzar, agregue un mililitro de caldo de glicerol de Mycobacterium smegmatis de tipo salvaje o recombinante a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de caldo 7H9 precalentado. Cierre la tapa y agite el tubo antes de incubar el cultivo durante la noche a 37 grados Celsius entre 200 y 220 RPM. Al día siguiente, cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance aproximadamente uno, centrifugar el cultivo a 3.200 G durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante en un recipiente de desecho líquido.Agregue un mililitro de medios Sautons precalentados y vuelva a suspender suavemente para obtener una suspensión uniforme. Aumente el volumen a 10 mililitros con medios Sautons. Vuelva a centrifugar y deseche el sobrenadante.Después del lavado, vuelva a suspender las células bacterianas. en 20 mililitros de medios Sautons precalentados y mida la densidad óptica a 600 nanómetros. Inocular el volumen requerido de suspensión bacteriana en un matraz Erlenmeyer de uno a dos litros que contenga 330 mililitros de medios Sautons e incubar a 37 grados Celsius a 200 RPM hasta que la densidad óptica alcance 0,3.Al día siguiente, lavar las células una vez como se demostró anteriormente y resuspender el pellet en 330 mililitros de Sautons conteniendo 1/10 Tween 80. Distribuya 50 mililitros de la suspensión celular en seis matraces de un litro, cada uno de los cuales contiene 280 mililitros de Sautons precalentados que contienen 1/10 Tween 80. Incubar los cultivos a 37 grados centígrados a 200 RPM hasta que la densidad óptica alcance de dos a 2,5.Agregue dos litros de cultivos de etapa exponencial media a seis botellas de 400 mililitros y centrifugue a 8.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante y los matraces o vasos de precipitados preenfriados en autoclave y almacene una alícuota del gránulo para procedimientos analíticos. El gránulo es coloreado si los EV son recombinantes para mCherry y marrón si son de tipo salvaje o recombinante para proteínas no fluorescentes.Filtre el sobrenadante de cultivo a través de un filtro de eliminación de 0,45 micras, seguido de una filtración a través de un filtro de 0,22 micras para eliminar todos los rastros de bacterias. A continuación, prelavar los concentradores de membrana de 30 kilodalton con 15 mililitros de agua bidestilada a 4.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar con 15 mililitros de medios Sautons fríos prefiltrados utilizando las mismas condiciones para eliminar todos los restos de productos químicos.Después del lavado, añadir 15 mililitros de sobrenadante cultivado filtrado en un concentrador y concentrar a 4.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el concentrado a un tubo de centrífuga Oak Ridge frío de 40 mililitros o a un tubo de centrífuga Falcon fresco de 50 mililitros. Una vez que se concentran los dos litros completos de filtrado de cultivo, transfiera el concentrado a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros doblemente destilado, lavado y preenfriado y sométalo a una centrifugación de dos pasos.Primero a 4.000 G, y luego a 15.000 G. Transfiera el concentrado centrifugado a un tubo de ultracentrífuga preenfriado de 38,5 mililitros y centrifugue a 100.000 G durante cuatro horas a cuatro grados Celsius. Recoja el sobrenadante en un tubo de centrífuga Falcon fresco de 50 mililitros preenfriado. invierta el tubo de ultracentrífuga sobre un papel absorbente nuevo y sin pelusa para eliminar los restos del sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 600 microlitros de tampón HEPES.Coloque el gránulo resuspendido en el fondo de un tubo de ultracentrífuga de polipropileno UltraClear preenfriado de 13 mililitros y mézclelo suavemente con cuatro mililitros de solución inerte de yodixanol con gradiente de densidad del 60 %. A continuación, superponga con un mililitro cada uno de 40%, 30%, 20% y 10% de yodixanol. Llene el tubo agregando cuatro mililitros de yodixanol al 6% en la parte superior.Después de pesar cuidadosamente el tubo en un vaso de precipitados de vidrio o en un soporte, transfiéralo suavemente a los cubos oscilantes y luego al rotor de los cubos oscilantes para la ultracentrifugación a 141.000 G durante 16 horas a cuatro grados centígrados. Después de la ultracentrifugación, retire con cuidado el tubo y recoja una fracción de un mililitro en tubos de microcentrífuga esterilizados en autoclave. El análisis TEM mostró que los VE micobacterianos son circulares y el análisis de seguimiento nanométrico confirmó que los VE de diferentes tamaños con diámetros que oscilan entre 20 y 250 nanómetros.Cuando el extremo N-terminal de mCherry se fusionó traduccionalmente con el extremo C-terminal de CFP-29, una porción de mEV enriquecidos de Msm se volvió rosada, lo que indica la capacidad de cf-29 para transportar una proteína extraña de interés. A continuación, se utilizó CFP-29 para evaluar la entrega de EsxA en los vehículos eléctricos de Msm. El EsxA de Mtb se observó en los vehículos eléctricos de Msm en bajas cantidades.CFP-29 EsxA 3X FLAG fue más estable y se acumuló en niveles más altos en mEV. El enriquecimiento de los VE a partir de micobacterias cultivadas en condiciones fisiológicas diferentes proporciona información sobre sus contenidos alterados y funciones modificadas que dictan la infectividad sostenida, la patogénesis y la propagación del patógeno.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flujo Virometry para analizar antigénica Spectra de viriones y extracelular Vesículas

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Aislamiento y caracterización de las vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...