Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Författarna tackar uppriktigt Prof. Sarah M. Fortune för att hon vänligen delade med sig av M. smegmatis mc2155 lager. De tackar också Servier Medical Art (smart.servier.com) för att ha tillhandahållit några grundläggande element för figur 1. De tackar uppriktigt för stödet från resten av laboratoriemedlemmarna för deras patientjusteringar under den långa användningen av inkubatorskakarna, centrifugerna och ultracentrifugerna för mEV-anrikning. De tackar också Surjeet Yadav, laboratorieassistenten, för att han alltid såg till att de nödvändiga glasen och förbrukningsvarorna alltid var tillgängliga och till hands. Slutligen tackar de THSTI:s administrativa, inköps- och ekonomiteam för deras ständiga stöd och hjälp med ett smidigt genomförande av projektet.

1. Tillväxtbetingelser för Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli och deras derivat
<ol><li>Media<ol><li>Middlebrook 7H9 flytande buljong<ol><li>Bered 20 % Tween-80 stamlösning genom att förvärma erforderlig volym dubbeldestillerat vatten (ddw) i en glasbägare till ~45-50 oC i mikrovågsugn, tillsätt erforderlig volym Tween-80 med hjälp av en lämplig mätcylinder och rör om kontinuerligt på en liten magnetomrörare för att f...

Eftersom det fortfarande är en formidabel utmaning att utveckla ett nytt tuberkulosvaccin som är överlägset och kan ersätta BCG, strävar flera grupper som ett alternativ efter upptäckten av olika subenhetsvacciner mot tuberkulos som kan öka BCG:s styrka och förlänga dess skyddstid48,49. Med tanke på den ökande uppmärksamheten på bakteriella EV (bEVs) som potentiella subenheter och som naturliga adjuvans50,51,<sup c...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Trots utveckling och administrering av ett brett utbud av vacciner mot infektionssjukdomar sker än i dag ~30 % av alla dödsfall på grund av smittsamma sjukdomar. Före tillkomsten av tuberkulosvaccinet (TBC) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - var tuberkulos den främsta dödsorsaken (~10 000 till 15 000/100 000 invånare)2. Med administrering av BCG och enkel tillgång till första och andra linjens läkemedel mot tuberkulos har antalet tuberkulosrelaterade dödsfall dramatiskt minskat till ~1 miljon/år år 2022 (dvs. ~15-20/100 000 invånare1). I tuberkulosendemiska populationer i världen fortsätter dock tuberkulosrelaterade dödsfall att ligga på ~100-550/100 000 invånare1. Även om experter känner till flera orsaker som leder till dessa skeva siffror, verkar BCG-medierat skydd som inte varar ens under det första decenniet av livet vara denframträdande orsaken 3,4,5,6,7. Med tanke på FN:s förnyade "mål för hållbar utveckling" och WHO:s strategi för att utrota tuberkulos finns det följaktligen en samlad global ansträngning för att utveckla ett mycket överlägset vaccinalternativ till BCG som kanske ger livslångt skydd mot tuberkulos.

För att uppnå detta mål utvärderar flera grupper för närvarande modifierade/rekombinanta BCG-stammar, icke-patogena och försvagade mykobakteriearter andra än BCG, och subenhetskandidater 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Vanligtvis är subenhetsvacciner liposomer som selektivt laddas med få renade (~1-6) fullängds- eller trunkerade immunogena proteiner av patogenen. Men på grund av deras falska veckning till icke-nativa konformationer och/eller slumpmässiga icke-funktionella interaktioner mellan de laddade proteinerna, saknar subenheter ofta nativa och germanska epitoper och misslyckas därför med att tillräckligt förbereda immunsystemet14,19,20.

Följaktligen har extracellulära vesiklar (EV) av bakterier tagit fart som ett lovande alternativ 21,22,23,24,25,26. Vanligtvis innehåller bakteriella EV (bEV) en delmängd av deras cellulära komponenter, inklusive vissa delar av nukleinsyror, lipider och hundratals metaboliter och proteiner27,28. Till skillnad från liposomer där ett fåtal renade proteiner är artificiellt laddade, innehåller bEVs hundratals naturligt laddade, naturligt veckade proteiner med en bättre benägenhet att förbereda immunsystemet, särskilt utan förstärkning/hjälp av adjuvans och Toll-like receptor (TLR) agonister27,28,29. Det är inom denna forskningslinje som vi och andra har undersökt användbarheten av mykobakteriella EV som potentiella subenhetsförstärkare till BCG30. Trots farhågor om att bEV saknar enhetliga antigenbelastningar har EV från försvagad Neisseria meningitidis framgångsrikt skyddat människor mot serogrupp B-meningokocker31,32.
Åtminstone teoretiskt sett är de bästa elbilarna som kan öka BCG väl de elbilar som är berikade med patogena bakterier. Att berika EV som genereras av patogen mykobakterie är dock dyrt, tidskrävande och riskabelt. Dessutom kan patogengenererade EV vara mer virulenta än skyddande. Med tanke på de potentiella riskerna rapporterar vi här ett väl beprövat protokoll för anrikning av elbilar som genereras av axeniskt odlad Msm, en avirulent mycobacterium.
Trots att avirulenta mykobakterier kodar för flera patogena proteinortologer saknar de dock flera vaccinantigener/patogena proteinepitoper som är nödvändiga för att förbereda immunsystemet tillräckligt för skydd33. Därför utforskade vi också att konstruera och berika rekombinanta EV av Msm genom molekylär ingenjörskonst, så att en betydande del av alla patogena proteiner av intresse som uttrycks och översätts i Msm, måste nå sina EVs. Vår hypotes var att ett eller flera av de 10 vanligaste proteinerna i Msm EV när de smälts samman med proteinet av intresse kommer att hjälpa till med en sådan translokation.
Medan vi började standardisera anrikningen av mykobakteriella EV (mEV) i vårt laboratorium, rapporterade Prados-Rosales et al. 2011 först visualisering och anrikning av mEV in vitro30. Senare, 2014, publicerade samma grupp en modifierad version av sin metod34 från 2011. År 2015 rapporterade Lee et al. också en oberoende standardiserad metod för mEV-anrikning igen från axeniska kulturer av mykobakterier35. Genom att kombinera båda protokollen 34,35 och införliva några av våra modifieringar efter grundlig standardisering, beskriver vi här ett protokoll som hjälper till att rutinmässigt berika mEV från axeniska kulturer av mykobakterier36.
Här beskriver vi särskilt anrikningen av MSM-specifika EVs, vilket är en förlängning av ett publicerat protokoll36 för anrikning av mykobakteriella EVs i allmänhet. Vi beskriver också hur man konstruerar rekombinanta mEVs (R-mEVs) som innehåller mCherry-proteinet (som en röd fluorescerande reporter) och EsxA (Esat-6)37,38,39, en dominerande immunogen och en potentiell subenhetsvaccinogen av Mycobacterium tuberculosis. Protokollet för att berika R-mEV:erna förblir identiskt med det vi har beskrivit för att berika inhemska EV:er från Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

De flesta bakterier, inklusive mykobakterier, genererar extracellulära vesiklar (EV). Eftersom bakteriella EV (bEV) innehåller en delmängd av cellulära komponenter, inklusive metaboliter, lipider, proteiner och nukleinsyror, har flera grupper utvärderat antingen de ursprungliga eller rekombinanta versionerna av bEV för deras skyddande styrka som subenhetsvaccinkandidater. Till skillnad från inhemska elfordon är rekombinanta elfordon molekylärt konstruerade för att innehålla en eller flera immunogener av intresse. Under det senaste decenniet har olika grupper utforskat olika metoder för att generera rekombinanta bEV. Men här rapporterar vi design, konstruktion och anrikning av rekombinanta mykobakteriella EV (mEV) i mykobakterier. För att göra det använder vi Mycobacterium smegmatis (Msm), en fågelmykobakterie i jorden som modellsystem. Vi beskriver först generering och berikning av inhemska elbilar av MSM. Därefter beskriver vi design och konstruktion av rekombinanta mEV som innehåller antingen mCherry, ett rött fluorescerande reporterprotein, eller EsxA (Esat-6), en framträdande immunogen av Mycobacterium tuberculosis. Vi uppnår detta genom att separat smälta samman mCherry och EsxA N-termini med C-terminalen av ett litet Msm-protein Cfp-29. Cfp-29 är ett av de få rikligt förekommande proteinerna i MsmEV. Protokollet för att generera och anrika rekombinanta mEV från Msm förblir identiskt med generering och anrikning av inhemska EV av Msm.

Vi använder M. smegmatis (Msm) som modell mykobakterie för att demonstrera anrikning av både nativa och rekombinanta mEV (R-mEV). Detta schematiskt sammanfattade mEV-anrikningsprotokoll (figur 1) fungerar också för anrikning av R-mEV av Msm och nativa EV av Mtb (med mindre modifieringar som i protokollanteckningar från 1.2). Visualisering av de anrikade mEV:erna kräver negativ färgning av dem under ett transmissionselektronmikroskop36 (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Detta protokoll beskriver anrikningen av inhemska mykobakteriella extracellulära vesiklar (mEV) från axeniska kulturer av Mycobacterium smegmatis (Msm) och hur mCherry (en röd fluorescerande reporter)-innehållande rekombinanta MsmEVs kan designas och anrikas. Slutligen verifieras det nya tillvägagångssättet genom anrikning av MsmEVs som innehåller EsxA-proteinet Mycobacterium tuberculosis.

Anrikning av naturliga och rekombinanta extracellulära vesiklar av mykobakterier

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Att berika mykobakteriella EV:er hjälper till att avgränsa deras innehåll, dechiffrera deras fraktioner och datera designa sätt att konstruera och generera rekombinanta EV:er som huvudsakligen utnyttjar vaccinkandidater. Sex serier genereras från olika platser på bakterieytan. De har inga bevarade markörer.Därför kan alla affinitetsbaserade metoder endast berika en delmängd av EV:erna. Däremot fångar vår metod alla genererade mykobakteriella EV. Mohd Ilyas, doktorand från mitt laboratorium, kommer att demonstrera proceduren.Till att börja med, tillsätt en milliliter glycerollager av vildtyp eller rekombinant Mycobacterium smegmatis till ett 50-milliliters centrifugrör som innehåller 10 milliliter förvärmd 7H9-buljong. Stäng locket och snurra röret innan du inkuberar kulturen över natten vid 37 grader Celsius mellan 200 och 220 varv per minut. Nästa dag, när den optiska densiteten vid 600 nanometer når ungefär ett, centrifugera kulturen vid 3 200 G i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten i en behållare för flytande avfall.Tillsätt en milliliter förvärmt Sautons-media och återsuspendera försiktigt för att få en jämn suspension. Fyll på volymen till 10 ml med hjälp av Sautons media. Centrifugera igen och kassera supernatanten.Efter tvätt återsuspenderar du bakteriecellerna. i 20 milliliter förvärmda Sautons-medier och mät den optiska densiteten vid 600 nanometer. Inokulera erforderlig volym bakteriesuspension i en en- till tvåliters Erlenmeyerkolv innehållande 330 ml Sauton-media och inkubera vid 37 grader Celsius i 200 varv per minut tills den optiska densiteten når 0,3.Nästa dag tvättas cellerna en gång som tidigare visats och pelleten återsuspenderas i 330 ml sauton innehållande 1/10 Tween 80. Fördela 50 ml av cellsuspensionen i sex enliterskolvar som var och en innehåller 280 ml förvärmda sauton innehållande 1/10 Tween 80. Inkubera kulturerna vid 37 grader Celsius i 200 rpm tills den optiska densiteten når 2 till 2,5.Tillsätt två liter kulturer i mitten av exponentialstadiet till sex 400-millilitersflaskor och centrifugera vid 8 000 g i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Samla upp supernatanten och de förkylda autoklaverade kolvarna eller bägarna och lagra en alikvot av pelleten för analys. Pelleten är färgad om EV:erna är rekombinanta för mCherry och bruna om de är vildtyps- eller rekombinanta för icke-fluorescerande proteiner.Filtrera grödans supernatant genom ett 0,45 mikron bortskaffningsfilter, följt av filtrering genom ett 0,22 mikron filter för att avlägsna alla spår av bakterier. Förtvätta sedan membrankoncentratorerna på 30 kilodalton med 15 milliliter dubbeldestillerat vatten vid 4 000 g i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Tvätta sedan med 15 milliliter förfiltrerat kallt Sauton-media under samma förhållanden för att ta bort alla spår av kemikalier.Efter tvättning tillsätts 15 ml filtrerad odlad supernatant i ett koncentratorium och koncentreras vid 4 000 g i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Överför koncentratet till ett kallt 40-milliliter Oak Ridge-centrifugrör eller ett 50-milliliter färskt Falcon-centrifugrör. När hela de två litrarna av odlingsfiltratet är koncentrerat, överför koncentratet till ett dubbeldestillerat, tvättat och förkylt 50-milliliter polypropencentrifugrör och utsätt det för en tvåstegscentrifugering.Först vid 4 000 g och sedan vid 15 000 g. Överför det centrifugerade koncentratet till ett förkylt 38,5 ml ultracentrifugrör och centrifugera vid 100 000 g i fyra timmar vid fyra grader Celsius. Samla upp supernatanten i ett förkylt 50 ml färskt Falcon-centrifugrör. vänd upp och ner på ultracentrifugröret på ett färskt, luddfritt absorberande papper för att ta bort spår av supernatanten och återsuspendera pelleten i 600 mikroliter HEPES-buffert.Lägg den återsuspenderade pelleten i botten av ett 13-milliliter förkylt UltraClear ultracentrifugrör av polypropen och blanda försiktigt med fyra milliliter inert 60% densitetsgradientjodixanollösning. Lägg sedan över med en milliliter vardera av 40%30%20%och 10% jodixanol. Fyll röret genom att tillsätta fyra milliliter 6%iodixanol på toppen.Efter att försiktigt ha vägt röret i en glasbägare eller ett stativ, överför det försiktigt till de svängande hinkarna och sedan till svängskopans rotor för ultracentrifugering vid 141 000 G i 16 timmar vid fyra grader Celsius. Efter ultracentrifugering, ta försiktigt bort röret och samla upp en fraktion på en milliliter i autoklaverade mikrocentrifugrör. TEM-analys visade att mykobakteriella EV är cirkulära och nanospårningsanalys bekräftade EV av olika storlek med diametrar mellan 20 och 250 nanometer.När den N-terminala änden av mCherry återförenades med den C-terminala änden av CFP-29, blev en del av de anrikade mEV av Msm rosa, vilket indikerar cf-29:s förmåga att bära ett främmande protein av intresse. CFP-29 användes sedan för att utvärdera EsxA-leverans till MSM-elbilar. Mtb:s EsxA observerades i MSM EV i små mängder.CFP-29 EsxA 3X FLAG var stabilare och ackumulerades på högre nivåer i mEV. Att berika EV från mykobakterier som odlats under fysiologiska olika förhållanden ger insikter i deras förändrade innehåll och modifierade funktioner som dikterar ihållande infektionsförmåga, patogenes och patogenspridning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinant retroviral Produktion och infektion av B-celler

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Peptid: MHC Tetramer-baserad Anrikning av Epitop-specifika T-celler

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualisering av Charcoal Agar Resazurin analys för Semi-kvantitativ, Medium genomströmning Räkning av mykobakterier

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flöde Virometry Analysera Antigen Spectra virioner och extracellulär Blåsor

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering och karakterisering av extracellulära blåsor från Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolering av extracellulära blåsor från murina bronkoalveolär Lavage vätska med ultrafiltrering centrifugering teknik

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generation, amplifiering och titrering av rekombinant respiratoriska Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...