Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Yazarlar, M. smegmatis mc2155 hissesini paylaşma nezaketini gösterdiği için Prof. Sarah M. Fortune'a içtenlikle teşekkür eder. Ayrıca, Şekil 1 için bazı temel unsurları sağladığı için Servier Medical Art'ı (smart.servier.com) kabul ederler. mEV zenginleştirme için inkübatör çalkalayıcıların, santrifüjlerin ve ultrasantrifüjlerin uzun kullanımı sırasında hasta ayarlamaları için laboratuvar üyelerinin geri kalanının desteğini içtenlikle kabul ederler. Ayrıca, gerekli cam eşyaların ve sarf malzemelerinin her zaman mevcut ve kullanışlı olduğundan emin olduğu için laboratuvar asistanı Bay Surjeet Yadav'a da teşekkür ediyorlar. Son olarak, THSTI'nin idari, satın alma ve finans ekiplerine sürekli destekleri ve projenin sorunsuz yürütülmesine yardımcı oldukları için teşekkür ederler.

1. Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli ve türevlerinin büyüme koşulları
<ol><li>Medya<ol><li>Middlebrook 7H9 sıvı et suyu<ol><li>Gerekli hacimde çift damıtılmış suyu (ddw) bir cam beherde mikrodalgada ~45-50 oC'ye önceden ısıtarak %20 Tween-80 stok çözeltisi hazırlayın, uygun bir ölçüm silindiri kullanarak gerekli hacimde Tween-80 ekleyin ve %20 Tween-80'i homojen bir çözelti haline getirmek için küçük bir...

BCG'den daha üstün olan ve BCG'nin yerini alabilecek yeni bir TB aşısı geliştirmek zorlu bir zorluk olmaya devam ettiğinden, alternatif olarak birkaç grup BCG'nin gücünü artırabilecek ve koruyucu süresini uzatabilecek farklı alt birim TB aşılarının keşfini sürdürmektedir48,49. Potansiyel alt birimler ve doğal adjuvanlar olarak bakteriyel EV'lere (bEV'ler) artan ilgi göz önüne alındığında50,51,<sup cl...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Bulaşıcı hastalıklara karşı çok çeşitli aşıların geliştirilmesine ve uygulanmasına rağmen, bugüne kadar bile, tüm insan ölümlerinin ~%30'u hala bulaşıcı hastalıklardan kaynaklanmaktadır1. Tüberküloz (TB) aşısının ortaya çıkmasından önce - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - TB bir numaralı katildi (~10.000 ila 15.000 / 100.000 nüfus)2. BCG'nin uygulanması ve birinci ve ikinci basamak anti-TB ilaçlarına kolay erişim ile 2022 yılına kadar, TB'ye bağlı ölümler 2022 yılına kadar ~1 milyon/yıl'a önemli ölçüde düşmüştür (yani, ~15-20/100.000 nüfus1). Bununla birlikte, dünyanın TB endemik popülasyonlarında, TB'ye bağlı ölümler ~ 100-550 / 100.000 nüfustadurmaya devam etmektedir 1. Uzmanlar bu çarpık sayılara yol açan çeşitli nedenleri kabul ederken, BCG aracılı korumanın yaşamın ilk on yılında bile sürmemesiöne çıkan neden gibi görünmektedir 3,4,5,6,7. Sonuç olarak, BM'nin yenilenen 'Sürdürülebilir Kalkınma Hedefleri' ve DSÖ'nün 'Tüberkülozu Bitirme Stratejisi' göz önüne alındığında, belki de tüberkülozdan ömür boyu koruma sağlayan BCG'ye çok daha üstün bir aşı alternatifi geliştirmek için ortak bir küresel çaba var.

Bu amaca yönelik olarak, şu anda birkaç grup modifiye / rekombinant BCG suşlarını, BCG dışındaki patojenik olmayan ve zayıflatılmış mikobakteriyel türleri ve alt birim adaylarınıdeğerlendirmektedir 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Tipik olarak, alt birim aşılar, patojenin birkaç saflaştırılmış (~ 1-6) tam uzunlukta veya kesilmiş immünojenik proteini ile seçici olarak yüklenmiş lipozomlardır. Bununla birlikte, doğal olmayan konformasyonlara sahte katlanmaları ve/veya yüklü proteinler arasındaki rastgele işlevsel olmayan etkileşimler nedeniyle, alt birimler genellikle doğal ve germane epitoplarından yoksundur ve bu nedenle bağışıklık sistemini yeterince hazırlayamaz14,19,20.

Sonuç olarak, bakterilerin hücre dışı vezikülleri (EV'ler) umut verici bir alternatif olarak hız kazanmıştır 21,22,23,24,25,26. Tipik olarak, bakteriyel EV'ler (bEV'ler), nükleik asitlerin, lipitlerin ve yüzlerce metabolit ve proteinin bazı kısımları dahil olmak üzere hücresel bileşenlerinin bir alt kümesini içerir27,28. Birkaç saflaştırılmış proteinin yapay olarak yüklendiği lipozomların aksine, bEV'ler, özellikle adjuvanların ve Toll benzeri reseptör (TLR) agonistlerinin desteği/yardımı olmadan, bağışıklık sistemini hazırlamak için daha iyi bir eğilime sahip, doğal olarak yüklenmiş, doğal olarak katlanmış yüzlerce protein içerir27,28,29. Bu araştırma hattında, biz ve diğerleri, mikobakteriyel EV'lerin BCG30'a potansiyel alt birim güçlendiriciler olarak faydasını araştırdık. bEV'lerin tek tip antijen yüklerinden yoksun olduğuna dair endişelere rağmen, zayıflatılmış Neisseria meningitidis'ten elde edilen EV'ler, insanları serogrup B meningokoklarına karşı başarıyla korumuştur31,32.
En azından teorik olarak, BCG'yi iyi bir şekilde artırabilecek en iyi EV'ler, patojenik bakterilerden zenginleştirilmiş EV'lerdir. Bununla birlikte, patojenik mikobakteri tarafından üretilen EV'leri zenginleştirmek pahalı, zaman alıcı ve risklidir. Ek olarak, patojen kaynaklı EV'ler koruyucu olmaktan çok öldürücü olabilir. Potansiyel riskler göz önüne alındığında, burada, avirulan bir mikobakteri olan aksenik olarak yetiştirilen Msm tarafından üretilen EV'lerin zenginleştirilmesi için iyi test edilmiş bir protokol bildiriyoruz.
Bununla birlikte, birkaç patojen protein ortologunu kodlamasına rağmen, avirulent mikobakteriler, bağışıklık sistemini korumaya yeterince hazırlamak için gerekli olan birkaç aşı antijeni/patojenik protein epitopundan yoksundur33. Bu nedenle, moleküler mühendislik yoluyla Msm'nin rekombinant EV'lerini oluşturmayı ve zenginleştirmeyi de araştırdık, öyle ki Msm'de ifade edilen ve çevrilen herhangi bir patojenik proteinin önemli bir kısmı EV'lerine ulaşmalıdır. Msm EV'lerin en bol bulunan 10 proteininden bir veya daha fazlasının, ilgilenilen proteine kaynaştığında bu tür bir translokasyona yardımcı olacağını varsaydık.
Laboratuvarımızda mikobakteriyel EV'lerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini standartlaştırmaya başlarken, 2011 yılında Prados-Rosales ve ark. ilk olarak mEV'lerin in vitro30'un görselleştirilmesini ve zenginleştirilmesini bildirdi. Daha sonra, 2014 yılında, aynı grup 2011 yöntem34'ün değiştirilmiş bir versiyonunu yayınladı. 2015 yılında, Lee ve ark. ayrıca mikobakterilerin35 aksenik kültürlerinden mEV zenginleştirme için bağımsız olarak standartlaştırılmış bir yöntem bildirdiler. Her iki protokolüde 34,35 birleştirerek ve kapsamlı standardizasyondan sonra modifikasyonlarımızdan birkaçını dahil ederek, burada mikobakterilerin 36 aksenik kültürlerinden mEV'leri rutin olarak zenginleştirmeye yardımcı olan bir protokolü açıklıyoruz.
Burada, genel olarak mikobakteriyel EV'lerin zenginleştirilmesi için yayınlanmış bir protokol36'nın bir uzantısı olan Msm'ye özgü EV'lerin zenginleştirilmesini özellikle detaylandırıyoruz. Ayrıca, mCherry proteinini (kırmızı floresan raportör olarak) ve EsxA'yı (Esat-6)37,38,39, baskın bir immünojen ve Mycobacterium tuberculosis'in potansiyel bir alt birim aşılayıcısı olarak içeren rekombinant mEV'lerin (R-mEV'ler) nasıl oluşturulacağını da detaylandırıyoruz. R-mEV'leri zenginleştirme protokolü, Msm'den yerel EV'leri zenginleştirmek için tanımladığımız protokolle aynı kalır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

Mikobakteriler de dahil olmak üzere çoğu bakteri, hücre dışı veziküller (EV'ler) üretir. Bakteriyel EV'ler (bEV'ler), metabolitler, lipitler, proteinler ve nükleik asitler dahil olmak üzere hücresel bileşenlerin bir alt kümesini içerdiğinden, birkaç grup, alt birim aşı adayları olarak koruyucu güçleri açısından bEV'lerin doğal veya rekombinant versiyonlarını değerlendirmiştir. Doğal EV'lerin aksine, rekombinant EV'ler, ilgilenilen bir veya daha fazla immünojen içerecek şekilde moleküler olarak tasarlanmıştır. Son on yılda, farklı gruplar rekombinant bEV'ler üretmek için çeşitli yaklaşımlar araştırdılar. Bununla birlikte, burada, mikobakterilerde rekombinant mikobakteriyel EV'lerin (mEV'ler) tasarımını, yapımını ve zenginleştirilmesini rapor ediyoruz. Bu doğrultuda, model sistem olarak avirulent bir toprak mikobakterisi olan Mycobacterium smegmatis'i (Msm) kullanıyoruz. İlk olarak, Msm'nin yerel EV'lerinin üretimini ve zenginleştirilmesini açıklıyoruz. Daha sonra, kırmızı bir floresan raportör proteini olan mCherry veya Mycobacterium tuberculosis'in belirgin bir immünojeni olan EsxA (Esat-6) içeren rekombinant mEV'lerin tasarımını ve yapımını açıklıyoruz. Bunu, mCherry ve EsxA N-terminalini küçük bir Msm proteini Cfp-29'un C-terminali ile ayrı ayrı kaynaştırarak başarıyoruz. Cfp-29, MsmEV'lerin bol miktarda bulunan birkaç proteininden biridir. Msm'den rekombinant mEV'ler üretme ve zenginleştirme protokolü, Msm'nin yerel EV'lerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi ile aynı kalır.

Hem doğal hem de rekombinant mEV'lerin (R-mEV'ler) zenginleşmesini göstermek için model mikobakteri olarak M. smegmatis (Msm) kullanıyoruz. Bu şematik olarak özetlenen mEV zenginleştirme protokolü (Şekil 1), Msm'nin R-mEV'lerinin ve Mtb'nin yerel EV'lerinin zenginleştirilmesi için de çalışır (1.2'nin protokol notlarında olduğu gibi küçük değişikliklerle). Zenginleştirilmiş mEV'lerin görselleştirilmesi, bunların bir transmisyon elektron mikroskobu<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Mikobakteriyel EV'leri zenginleştirmek, içeriklerini tanımlamaya, gruplarını deşifre etmeye ve esas olarak aşı adaylarından yararlanan rekombinant EV'ler inşa etmenin ve üretmenin yollarını tasarlamaya yardımcı olur. Altı seri, bakteri yüzeyinin farklı yerlerinden üretilir. Korunmuş belirteçleri yoktur.Bu nedenle, herhangi bir yakınlık temelli yaklaşım, EV'lerin yalnızca bir alt kümesini zenginleştirebilir. Buna karşılık, yöntemimiz üretilen tüm mikobakteri EV'lerini yakalar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Mohd Ilyas olacak.Başlamak için, 10 mililitre önceden ısıtılmış 7H9 et suyu içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne bir mililitre gliserol stoğu vahşi tip veya rekombinant Mycobacterium smegmatis ekleyin. Kapağı kapatın ve kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede 200 ila 220 RPM arasında inkübe etmeden önce tüpü döndürün. Ertesi gün, 600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık bire ulaştığında, kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.200 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı sıvı bir ıskarta kabına atın.Bir mililitre önceden ısıtılmış Sautons ortamı ekleyin ve tek tip bir süspansiyon elde etmek için hafifçe yeniden askıya alın. Sautons ortamını kullanarak hacmi 10 mililitreye çıkarın. Tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın.Yıkadıktan sonra bakteri hücrelerini tekrar süspanse edin. 20 mililitre önceden ısıtılmış Sautons ortamında ve optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. Gerekli hacimde bakteri süspansiyonunu 330 mililitre Sauton ortamı içeren bir ila iki litrelik bir Erlenmeyer şişesine aşılayın ve optik yoğunluk 0.3'e ulaşana kadar 200 RPM'de 37 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, hücreleri daha önce gösterildiği gibi bir kez yıkayın ve peleti 1/10 Tween 80 içeren 330 mililitre Sauton içinde yeniden süspanse edin. 50 mililitre hücre süspansiyonunu, her biri 1/10 Tween 80 içeren 280 mililitre önceden ısıtılmış Sauton içeren altı adet bir litrelik şişeye dağıtın. Kültürleri, optik yoğunluk iki ila 2.5'e ulaşana kadar 200 RPM'de 37 santigrat derecede inkübe edin.Altı adet 400 mililitrelik şişeye iki litre orta-üstel aşama kültürü ekleyin ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatan ve önceden soğutulmuş otoklavlanmış şişeleri veya beherleri toplayın ve analitik prosedürler için peletin bir kısmını saklayın. EV'ler mCherry için rekombinant ise pelet renklendirilir ve vahşi tip veya floresan olmayan proteinler için rekombinant ise kahverengidir.Kültür süpernatantını 0,45 mikronluk bir atık filtreden süzün, ardından tüm bakteri izlerini gidermek için 0,22 mikronluk bir filtreden süzün. Daha sonra, 30 kilodaltonluk membran yoğunlaştırıcıları 15 mililitre çift damıtılmış su ile 4.000 G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca önceden yıkayın. Ardından, tüm kimyasal izlerini gidermek için aynı koşulları kullanarak 15 mililitre önceden filtrelenmiş soğuk Sautons ortamıyla yıkayın.Yıkadıktan sonra, bir yoğunlaştırıcıya 15 mililitre filtrelenmiş kültürlenmiş süpernatan ekleyin ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 4.000 G'de konsantre edin. Konsantreyi soğuk 40 mililitrelik Oak Ridge santrifüj tüpüne veya 50 mililitrelik taze Falcon santrifüj tüpüne aktarın. İki litre kültür süzüntüsünün tamamı konsantre edildikten sonra, konsantreyi çift damıtılmış, yıkanmış ve önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir polipropilen santrifüj tüpüne aktarın ve iki aşamalı bir santrifüjlemeye tabi tutun.Önce 4.000 G'de ve daha sonra 15.000 G'de santrifüjlenmiş konsantreyi önceden soğutulmuş 38.5 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede dört saat boyunca 100.000 G'de döndürün. Süpernatanı önceden soğutulmuş 50 mililitrelik taze bir Falcon santrifüj tüpünde toplayın. süpernatan izlerini gidermek için ultrasantrifüj tüpünü taze, tüy bırakmayan emici bir kağıt üzerinde ters çevirin ve peleti 600 mikrolitre HEPES tamponunda yeniden süspanse edin.Yeniden süspanse edilmiş peleti 13 mililitrelik önceden soğutulmuş UltraClear polipropilen ultrasantrifüj tüpünün dibine yerleştirin ve dört mililitre inert %60 yoğunluklu gradyan iyodiksanol çözeltisi ile hafifçe karıştırın. Daha sonra her biri bir mililitre %40, %30, %20 ve %10 iyodiksanol ile kaplayın. Üstüne dört mililitre% 6 iyodiksanol ekleyerek tüpü doldurun.Tüpü bir cam beher veya bir stand içinde dikkatlice tarttıktan sonra, yavaşça sallanan kovalara ve ardından dört santigrat derecede 16 saat boyunca 141.000 G'de ultrasantrifüjleme için sallanan kova rotoruna aktarın. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpü dikkatlice çıkarın ve otoklavlanmış mikrosantrifüj tüplerine bir mililitrelik bir fraksiyon toplayın. TEM analizi, mikobakteriyel EV'lerin dairesel olduğunu gösterdi ve nano izleme analizi, çapları 20 ila 250 nanometre arasında değişen farklı büyüklükteki EV'leri doğruladı.mCherry'nin N-terminal ucu, CFP-29'un C-terminal ucuna translasyonel olarak kaynaştırıldığında, Msm'nin zenginleştirilmiş mEV'lerinin bir kısmı pembeye döndü ve cf-29'un ilgilenilen yabancı bir proteini taşıma yeteneğini gösterdi. CFP-29 daha sonra Msm EV'lere EsxA teslimatını değerlendirmek için kullanıldı. Mtb'nin EsxA'sı, Msm EV'lerde düşük miktarlarda gözlemlendi.CFP-29 EsxA 3X FLAG daha kararlıydı ve mEV'lerde daha yüksek seviyelerde birikmişti. EV'lerin fizyolojik farklı koşullar altında yetiştirilen mikobakterilerden zenginleştirilmesi, sürekli enfektivite, patogenez ve patojen yayılımını belirleyen değiştirilmiş içerikleri ve değiştirilmiş işlevleri hakkında fikir verir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...