Name: improvement of bacillus subtilis spore enumeration and label analysis in flow cytometry
Uploaded: 2023-06-30T12:40:00
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Cette étude a été financée en partie par le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Code de finances 001 ; Governo do Estado do Amazonas avec des ressources de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM ; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Les auteurs remercient le Programme de développement technologique des outils pour la santé PDTIS-FIOCRUZ pour l’utilisation de ses installations.

Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Réglage de la cytométrie en flux
<ol><li>Alignement des paramètres optiques d’un cytomètre en flux couplé à un ordinateur<ol><li>Connectez-vous au logiciel Cytometer.</li>
		<li>Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre | Démarrez et attendez quelques minutes |...

<ol>
	<li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+endospore:+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).</li><li>Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+immobilization+of+recombinant+organophosphorus+hydrolase+on+spores+of+Bacillus+subtilis.">Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).</li><li>Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Bacillus+subtilis+spore+isolation+and+quantifying+spore+harvest+purity.">Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).</li><li>Nicholson, W. L., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation,+germination+and+outgrowth.">Sporulation, germination and outgrowth.</a> Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Mora-Uribe, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adherence+of+Clostridium+difficile+spores:+the+integrity+of+the+outermost+layer+affects+adherence+properties+of+spores+of+the+epidemic+strain+R20291+to+components+of+the+intestinal+mucosa.">Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).</li><li>Paidhungat, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ger+proteins+in+nutrient+and+nonnutrient+triggering+of+spore+germination+in+Bacillus+subtilis.">Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).</li><li>Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TruCount+absolute-count+tubes+for+determining+CD4+and+CD8+cell+numbers+in+human+immunodeficiency+virus-positive+adults.+Site+Investigators+and+The+NIAID+DAIDS+New+Technologies+Evaluation+Group.">Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).</li><li>Godfrey, A., Alsharif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+viable+spores+by+flow+cytometry.">Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry.</a> US Patent. , (2003).</li><li>Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+isolation+of+Bacillus+subtilis+spores+using+cell+sorting+and+automated+gating.">Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating.</a> PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).</li><li>Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+spore+enumeration+using+flow+cytometry:+A+proof+of+concept+for+probiotic+application.">Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application.</a> Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).</li><li>Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+permeabilization+and+activity+recovery+of+Bacillus+spores+in+adverse+conditions+for+growth.">Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth.</a> Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).</li><li>Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+bacterial+spore+germination.">Biomarkers of bacterial spore germination.</a> Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).</li><li>Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+adsorption+as+a+nonrecombinant+display+system+for+enzymes+and+antigens.">Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens.</a> Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killed+Bacillus+subtilis+spores+as+a+mucosal+adjuvant+for+an+H5N1+vaccine.">Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine.</a> Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).</li></ol>

Les méthodes traditionnelles, telles que le comptage sur plaque des colonies, prennent non seulement du temps, mais nécessitent également des cellules viables et ne permettent pas de quantifier les spores inactivées5. La chambre Petroff-Hausser est une méthodologie alternative, mais elle nécessite un microscopiste expérimenté pour la réaliser. La cytométrie en flux s’est avérée être une alternative utile à cette fin.
Genovese et al.12</...

Bacillus subtilis est une bactérie gram-positive en forme de bâtonnet qui est capable de produire des spores au repos lorsque les conditions environnementales ne permettent pas la croissance cellulaire1. Les spores sont des formes cellulaires extrêmement stables et celles de plusieurs espèces, dont B. subtilis, sont largement utilisées comme probiotiques à usage humain et animal2. En raison de ses propriétés de résistance et d’innocuité, la spore de B. subtilis, qui présente des protéines hétérologues, a été proposée comme adjuvant muqueux, système d’administration de vaccins et plate-forme d’immobilisation enzymatique 3,4.
Pour obtenir des spores de B. subtilis, il est nécessaire de l’exposer à une privation de nutriments à l’aide d’un milieu de culture spécial. Après avoir obtenu et purifié ces spores, il faut les quantifier pour améliorer l’efficacité du test 5,6. Ainsi, certaines méthodes sont appliquées pour analyser la concentration des spores obtenues. Il est possible d’utiliser le comptage des plaques et une chambre Petroff-Hausser, également connue sous le nom de chambre de comptage. Ce dernier a été développé à l’origine pour déterminer la concentration des cellules sanguines ; Cependant, il est possible de l’utiliser dans le domaine de la microbiologie pour le comptage des spores 7,8. Bien qu’il s’agisse de la méthode standard utilisée pour le comptage cellulaire, la lecture est laborieuse car cette méthode est entièrement manuelle et sa précision dépend de l’expérience de l’opérateur.
Les analyses basées sur la cytométrie en flux (FC) ont déjà été proposées comme des approches rapides, fiables et spécifiques pour détecter les cellules marquées de Bacillus spp. L’utilisation de billes de comptage de cytométrie en flux a permis de garantir la reproductibilité dans le comptage cellulaire, dans les examens de routine (numération absolue des lymphocytes T CD4 et CD8) et dans le développement de la recherche portant sur des particules susceptibles d’être détectées et comptées par cytométrie en flux9. Godjafrey et Alsharif ont suggéré l’utilisation de billes de comptage pour la quantification de la FC des spores non marquées10. L’utilisation de la cytométrie en flux a été décrite pour le suivi de la sporulation chez Bacillus spp. par marquage de l’ADN des spores 10,11,12,13. Une autre étude a utilisé FC pour évaluer la quantité de protéines marquées par fluorescence à la surface des spores15.
Cette étude visait à utiliser des billes de comptage commerciales pour assurer une norme de reproductibilité en ce qui concerne le comptage d’événements à l’aide de la cytométrie en flux. Dans cet article, nous suggérons l’utilisation de billes de comptage pour le comptage cellulaire dans la FC afin d’affiner le dénombrement des spores et d’évaluer l’efficacité du couplage des anticorps marqués par fluorescence à la surface des spores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>341006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N-hydroxysuccinimide) (NHS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human fluorescent antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>501410</td>
			<td>APC anti-human IL-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse fluorescent antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td>Alexa Fluor Plus 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>&#160;BD</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)</td>
			<td>BD</td>
			<td>642412</td>
			<td>Quality control reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software v. 6.1.3</td>
			<td>BD</td>
			<td>643629</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge MegaFuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>340334</td>
			<td>TruCount Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent Microsope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Ludwig Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Microtubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improvement of bacillus subtilis spore enumeration and label analysis in flow cytometry

Les spores de Bacillus subtilis ont déjà été proposées pour différentes applications biotechnologiques et immunologiques ; Cependant, il est de plus en plus nécessaire de développer des méthodologies qui améliorent la détection des antigènes immobilisés à la surface des spores ainsi que leur quantification. Les analyses basées sur la cytométrie en flux ont déjà été proposées comme des approches rapides, fiables et spécifiques pour détecter les cellules marquées de B. subtilis. Ici, nous proposons l’utilisation de la cytométrie en flux pour évaluer l’efficacité d’affichage d’un anticorps fluorescent (FA) à la surface de la spore et quantifier le nombre de spores à l’aide de billes de comptage. 
Pour cela, nous avons utilisé le bromure d’éthidium comme marqueur d’ADN et un anticorps marqué à l’allophycocyanine (APC), qui a été couplé aux spores, comme marqueur de surface. La quantification des spores a été réalisée à l’aide de billes de comptage car cette technique démontre une grande précision dans la détection des cellules. Les spores marquées ont été analysées à l’aide d’un cytomètre en flux, ce qui a confirmé le couplage. En conséquence, il a été démontré que le marquage de l’ADN améliorait la précision de la quantification par cytométrie en flux, pour la détection des spores germées. On a observé que le bromure d’éthidium n’était pas en mesure de marquer les spores dormantes ; Cependant, cette technique permet de déterminer plus précisément le nombre de spores avec des protéines fluorescentes couplées à leur surface, contribuant ainsi au développement d’études axées sur l’utilisation des spores comme plate-forme biotechnologique dans différentes applications.

Dans les échantillons de spores autoclavées (SA), 2 × 103 spores/μl et 1 × 103 spores/μl ont été détectées à l’aide de billes de comptage et de la méthode de Petroff-Hausser, respectivement (figure 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65141/65141fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma général de quantification des spores. (A</s...

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Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

Ce protocole se concentre sur l’utilisation de la cytométrie en flux et des billes de comptage pour quantifier les spores bactériennes marquées au bromure d’éthidium. La méthode est également efficace pour analyser le couplage covalent des protéines à la surface des spores intactes.

Amélioration du dénombrement des spores de Bacillus subtilis et de l’analyse des marquages en cytométrie en flux

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Le comptage cellulaire des spores de Bacillus subtilis à l’aide de méthodes traditionnelles peut être une tâche laborieuse, car ces méthodes peuvent être entièrement manuelles et leur précision dépend de l’expérience de l’opérateur. Ce protocole permet le dénombrement des spores dormantes et en germination. De plus, la technique permet également de déterminer le pourcentage d’adaptation des protéines fluorescentes à sa surface.Compte tenu de l’étape de mise en place présente dans ce protocole, la vision démontre avec les installations, la compréhension technique et le détail des soins dans cette exécution. Commencez par vous connecter au logiciel du cytomètre. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre, puis Démarrage fluidique.Choisissez ensuite Modes de nettoyage. Et enfin, lancez SIT Flush. Prenez 50 microlitres de spores d’autoclave et incubez-les avec du bromure d’éthidium à un facteur de dilution de 0,05% volume par volume pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.Lavez les spores trois fois avec du PBS en centrifugeant à 17 949 G pendant 10 minutes et en les remettant en suspension dans du PBS. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de billes en suivant les recommandations du fabricant pour la dilution et analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux. Définir la stratégie de déclenchement en fonction des caractéristiques morphométriques et de fluorescence des particules en utilisant le témoin négatif comme référence.Mélangez ensuite le tube délicatement. Attachez-le à la sonde du cytomètre en flux et cliquez sur Acquérir. Pour régler la puissance du laser, allez dans l’onglet paramètres de la fenêtre du cytomètre, réglez la diffusion vers l’avant sur 375 et la diffusion latérale sur 275.Sélectionnez ensuite l’onglet Seuil et définissez-le sur 500. Ensuite, analysez l’échantillon sans colorant contenant uniquement des spores pour éliminer l’autofluorescence. Dans l’onglet des paramètres, ajustez les tensions du détecteur de filtre trois sur 603 et les tensions du détecteur de filtre cinq sur 538 pour différencier les populations négatives des populations positives à l’aide de la fluorescence dans les témoins.Cliquez ensuite sur Compensation et définissez le décalage de configuration du détecteur de filtre 5 par 3 sur un. Pour configurer l’appareil pour l’acquisition, sélectionnez Expérimenter, choisissez la disposition de l’expérience et définissez l’acquisition sur 30 000 événements. Après avoir ajusté les paramètres, acquérez des données pour les échantillons qui sont étiquetés et contiennent des billes dans le cytomètre en flux.Centrifuger 50 microlitres de spores à 17, 949 G pendant 10 minutes. Ensuite, remettez les spores en suspension à l’aide de 25 microlitres de carbodiimide de 1-éthyl-3-3-diméthylaminopropyl et incubez pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de N-hydroxysulfosuccinimide à une concentration de 50 millimolaires à la suspension de spores.Incuber la suspension de spores à température ambiante pendant 30 minutes. Lavez les spores trois fois avec du PBS en centrifugeant comme indiqué précédemment. Ajoutez des protéines fluorescentes aux échantillons et incubez-les pendant la nuit à 15 degrés Celsius.Ajoutez 10 milligrammes par millilitre de bromure d’éthidium dilué à 1 à 50, puis laissez les échantillons sur de la glace pendant une heure, à l’abri de la lumière. Après avoir lavé les spores et défini les portes comme indiqué précédemment, modifiez les paramètres du détecteur de filtre trois sur l’axe des x et du détecteur de filtre cinq sur l’axe des y du graphique à points. La méthode de comptage des billes a détecté deux fois 10 à trois spores par microlitre dans les échantillons de spores en autoclave.Une coloration au bromure d’éthidium d’échantillons de spores d’autoclave a montré une intensité de fluorescence moyenne plus élevée que la coloration de spores non autoclavées, ce qui indique une coloration plus importante du matériel génétique. La surface des spores de l’autoclave, associée à l’anticorps anti-interleukine 10 humain marqué par APC, a montré une plus grande efficacité de couplage par rapport aux spores non autoclavées. La présence de spores perméables au bromure d’éthidium indique la présence possible de spores germées dans l’ensemble de la population.Sur la base des analyses de cytométrie en flux, il a été observé que l’anticorps fluorescent présentait un pourcentage plus élevé de couplage avec les spores dormantes par rapport aux spores germées. De plus, à mesure que la concentration d’anticorps fluorescents augmentait, une augmentation du pourcentage de spores couplées et de l’intensité moyenne de fluorescence a été observée. Il est important d’effectuer une homogénéisation complète des billes de courant pour assurer des lectures précises grâce à la cytométrie en flux et au dénombrement précis des spores.En normalisant la concentration d’antigènes attachés aux spores, des études canadiennes analysent l’utilisation des spores comme anticorps vaccinaux.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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