Name: improvement of bacillus subtilis spore enumeration and label analysis in flow cytometry
Uploaded: 2023-06-30T12:40:00
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इस अध्ययन को Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 द्वारा वित्तपोषित किया गया था; Governo do Estado do Amazonas Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM के संसाधनों के साथ; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). लेखक अपनी सुविधाओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य PDTIS-FIOCRUZ के लिए उपकरण में तकनीकी विकास के लिए कार्यक्रम का धन्यवाद करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. फ्लो साइटोमेट्री सेटिंग
<ol><li>एक कंप्यूटर से युग्मित...

<ol>
	<li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+endospore:+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).</li><li>Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+immobilization+of+recombinant+organophosphorus+hydrolase+on+spores+of+Bacillus+subtilis.">Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).</li><li>Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Bacillus+subtilis+spore+isolation+and+quantifying+spore+harvest+purity.">Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).</li><li>Nicholson, W. L., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation,+germination+and+outgrowth.">Sporulation, germination and outgrowth.</a> Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Mora-Uribe, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adherence+of+Clostridium+difficile+spores:+the+integrity+of+the+outermost+layer+affects+adherence+properties+of+spores+of+the+epidemic+strain+R20291+to+components+of+the+intestinal+mucosa.">Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).</li><li>Paidhungat, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ger+proteins+in+nutrient+and+nonnutrient+triggering+of+spore+germination+in+Bacillus+subtilis.">Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).</li><li>Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TruCount+absolute-count+tubes+for+determining+CD4+and+CD8+cell+numbers+in+human+immunodeficiency+virus-positive+adults.+Site+Investigators+and+The+NIAID+DAIDS+New+Technologies+Evaluation+Group.">Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).</li><li>Godfrey, A., Alsharif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+viable+spores+by+flow+cytometry.">Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry.</a> US Patent. , (2003).</li><li>Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+isolation+of+Bacillus+subtilis+spores+using+cell+sorting+and+automated+gating.">Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating.</a> PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).</li><li>Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+spore+enumeration+using+flow+cytometry:+A+proof+of+concept+for+probiotic+application.">Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application.</a> Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).</li><li>Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+permeabilization+and+activity+recovery+of+Bacillus+spores+in+adverse+conditions+for+growth.">Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth.</a> Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).</li><li>Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+bacterial+spore+germination.">Biomarkers of bacterial spore germination.</a> Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).</li><li>Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+adsorption+as+a+nonrecombinant+display+system+for+enzymes+and+antigens.">Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens.</a> Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killed+Bacillus+subtilis+spores+as+a+mucosal+adjuvant+for+an+H5N1+vaccine.">Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine.</a> Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).</li></ol>

कालोनियों की प्लेट गिनती जैसे पारंपरिक तरीके, न केवल समय लेने वाली हैं, बल्कि व्यवहार्य कोशिकाओं की भी आवश्यकता होती है और निष्क्रिय बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति नहीं देते हैं5. प?...

बैसिलस सबटिलिस एक रॉड के आकार का, ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु है जो मौन बीजाणुओं का उत्पादन करने में सक्षम होता है जब पर्यावरणीय परिस्थितियां कोशिका वृद्धि की अनुमति नहीं देती हैं1. बीजाणु अत्यंत स्थिर कोशिका रूप हैं और बी सबटिलिस सहित कई प्रजातियों के हैं, व्यापक रूप से मानव और पशु उपयोग के लिए प्रोबायोटिक्स के रूप में उपयोग किए जाते हैं2. इसके प्रतिरोध और सुरक्षा गुणों के कारण, बी सबटिलिस का बीजाणु, जो विषम प्रोटीन प्रदर्शित करता है, को म्यूकोसल सहायक, एक टीका वितरण प्रणाली और एक एंजाइम-स्थिरीकरण मंच 3,4 के रूप में प्रस्तावित किया गया है।
 बी सबटिलिस से बीजाणु प्राप्त करने के लिए, एक विशेष संस्कृति माध्यम का उपयोग करके पोषक तत्वों की कमी के लिए इसे उजागर करना आवश्यक है। इन बीजाणुओं को प्राप्त करने और शुद्ध करने के बाद, परीक्षण दक्षता 5,6 में सुधार करने के लिए उन्हें निर्धारित करना चाहिए। इस प्रकार, प्राप्त बीजाणुओं की एकाग्रता का विश्लेषण करने के लिए कुछ तरीकों को लागू किया जाता है। प्लेट की गिनती और एक पेट्रोफ-हौसर कक्ष, जिसे गिनती कक्ष के रूप में भी जाना जाता है, का उपयोग किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध मूल रूप से रक्त कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया था; हालांकि, बीजाणु गिनती 7,8 के लिए सूक्ष्म जीव विज्ञान के क्षेत्र में इसका उपयोग करना संभव है। सेल गिनती के लिए उपयोग की जाने वाली मानक विधि होने के बावजूद, पढ़ना श्रमसाध्य है क्योंकि यह विधि पूरी तरह से मैनुअल है और इसकी सटीकता ऑपरेटर के अनुभव पर निर्भर करती है।
फ्लो साइटोमेट्री-आधारित (एफसी) विश्लेषण को पहले बेसिलस एसपीपी की लेबल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए तेज, विश्वसनीय और विशिष्ट दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। प्रवाह cytometry मोती गिनती के उपयोग नियमित परीक्षाओं (CD4 और CD8 टी लिम्फोसाइटों की निरपेक्ष गिनती) में सेल गिनती में प्रजनन क्षमता की गारंटी दी है और पता लगाया जा रहा है और प्रवाह cytometry9 का उपयोग कर गिना जा करने में सक्षम कणों से जुड़े अनुसंधान के विकास में. Godjafrey और Alsharif unlabeled बीजाणुओं10 के एफसी परिमाणीकरण के लिए मोतियों की गिनती के उपयोग का सुझाव दिया. बैसिलस एसपीपी में स्पोरुलेशन की निगरानी के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग वर्णित किया गया था।बीजाणु डीएनए10,11,12,13 लेबल के माध्यम से। फिर भी एक अन्य अध्ययन एफसी बीजाणु सतह15 पर फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन की मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया.
इस अध्ययन ने प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके घटना की गिनती के संबंध में प्रजनन क्षमता के मानक को सुनिश्चित करने के लिए वाणिज्यिक गिनती मोतियों का उपयोग करने की मांग की। इसमें, हम बीजाणु गणना को परिष्कृत करने और बीजाणु सतह पर फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी की युग्मन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एफसी में सेल गिनती के लिए मोतियों की गिनती के उपयोग का सुझाव देते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>341006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N-hydroxysuccinimide) (NHS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human fluorescent antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>501410</td>
			<td>APC anti-human IL-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse fluorescent antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td>Alexa Fluor Plus 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>&#160;BD</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)</td>
			<td>BD</td>
			<td>642412</td>
			<td>Quality control reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software v. 6.1.3</td>
			<td>BD</td>
			<td>643629</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge MegaFuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>340334</td>
			<td>TruCount Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent Microsope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Ludwig Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Microtubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improvement of bacillus subtilis spore enumeration and label analysis in flow cytometry

बैसिलस सबटिलिस के बीजाणु पहले से ही विभिन्न जैव प्रौद्योगिकी और प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुप्रयोगों के लिए प्रस्तावित किए गए हैं; हालांकि, उन पद्धतियों के विकास की बढ़ती आवश्यकता है जो बीजाणुओं की सतह पर स्थिर एंटीजन का पता लगाने में सुधार करते हैं, साथ ही उनकी मात्रा का ठहराव भी करते हैं। फ्लो साइटोमेट्री-आधारित विश्लेषण को पहले बी सबटिलिस की लेबल वाली कोशिकाओं का पता लगाने के लिए तेज, विश्वसनीय और विशिष्ट दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। इसमें, हम बीजाणु की सतह पर एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (एफए) की प्रदर्शन दक्षता का मूल्यांकन करने और गिनती मोतियों का उपयोग करके बीजाणुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग का प्रस्ताव करते हैं।
इसके लिए, हमने एथिडियम ब्रोमाइड को डीएनए मार्कर और एक एलोफिकोसायनिन (एपीसी) लेबल एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया, जिसे सतह मार्कर के रूप में बीजाणुओं के साथ जोड़ा गया था। बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव मोतियों की गिनती का उपयोग करके किया गया था क्योंकि यह तकनीक कोशिकाओं का पता लगाने में उच्च सटीकता प्रदर्शित करती है। लेबल बीजाणुओं का विश्लेषण एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके किया गया था, जिसने युग्मन की पुष्टि की। नतीजतन, यह प्रदर्शित किया गया था कि डीएनए लेबलिंग ने अंकुरित बीजाणुओं का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परिमाणीकरण की सटीकता में सुधार किया है। यह देखा गया कि एथिडियम ब्रोमाइड निष्क्रिय बीजाणुओं को लेबल करने में सक्षम नहीं था; हालांकि, यह तकनीक उनकी सतह पर युग्मित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ बीजाणुओं की संख्या का अधिक सटीक निर्धारण प्रदान करती है, इस प्रकार अध्ययन के विकास में मदद करती है जो विभिन्न अनुप्रयोगों में जैव प्रौद्योगिकी मंच के रूप में बीजाणुओं के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करती है।

ऑटोक्लेव्ड बीजाणु (एएस) नमूनों में, क्रमशः गिनती मोतियों और पेट्रोफ-हॉसर विधि का उपयोग करके 2 × 103 बीजाणु/μl और 1 × 103 बीजाणु/μl का पता लगाया गया था(चित्र 2)।
<img alt="Figure 1" ...

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Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

यह प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग पर केंद्रित है और एथिडियम ब्रोमाइड के साथ लेबल किए गए जीवाणु बीजाणुओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए मोतियों की गिनती करता है। विधि बरकरार बीजाणुओं की सतह पर प्रोटीन के सहसंयोजक युग्मन का विश्लेषण करने के लिए भी कुशल है।

फ्लो साइटोमेट्री में बैसिलस सबटिलिस बीजाणु गणना और लेबल विश्लेषण में सुधार

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके बैसिलस सबटिलिस बीजाणुओं का सेल काउंटर एक श्रमसाध्य कार्य हो सकता है, क्योंकि ये विधियां ऑपरेटर के अनुभव के आधार पर पूरी तरह से मैनुअल और उनकी सटीकता हो सकती हैं। यह प्रोटोकॉल निष्क्रिय और अंकुरित बीजाणुओं की गणना को संभव बनाता है। इसके अलावा, तकनीक इसकी सतह पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के मुकाबला करने का प्रतिशत निर्धारित करना भी संभव बनाती है।इस प्रोटोकॉल में मौजूद सेटअप कदम को देखते हुए, दृष्टि सुविधाओं और तकनीकी समझ और इस निष्पादन में देखभाल के विस्तार के साथ प्रदर्शित करती है। साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में लॉग इन करके शुरू करें। सॉफ़्टवेयर कार्यक्षेत्र में, साइटोमीटर का चयन करें, उसके बाद फ्लुइडिक स्टार्टअप का चयन करें।फिर सफाई मोड चुनें। आणि शेवटी, SIT फ्लश सुरू करा. आटोक्लेव बीजाणुओं के 50 माइक्रोलीटर लें और उन्हें प्रकाश से सुरक्षित 30 मिनट के लिए मात्रा द्वारा 0.05% मात्रा के कमजोर पड़ने वाले कारक पर एथिडियम ब्रोमाइड के साथ सेते हैं।10 मिनट के लिए 17, 949 जी पर अपकेंद्रित्र करके पीबीएस के साथ बीजाणुओं को तीन बार धोएं, और पीबीएस में फिर से निलंबित करें। अगला, कमजोर पड़ने के लिए निर्माता की सिफारिशों के बाद मोतियों के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर नमूना का विश्लेषण. एक संदर्भ के रूप में नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर कणों के morpho-मीट्रिक और प्रतिदीप्ति विशेषताओं के आधार पर गेटिंग रणनीति को परिभाषित करें.फिर ट्यूब को धीरे से मिलाएं। इसे फ्लो साइटोमीटर जांच में संलग्न करें और अधिग्रहण पर क्लिक करें। लेजर पावर सेट करने के लिए, साइटोमीटर विंडो में पैरामीटर टैब पर जाएं, फॉरवर्ड स्कैटर को 375 और साइड स्कैटर को 275 पर एडजस्ट करें।फिर थ्रेशोल्ड टैब चुनें और इसे 500 पर सेट करें। अगला, ऑटोफ्लोरेसेंस को खत्म करने के लिए केवल बीजाणुओं वाले डाई-मुक्त नमूने का विश्लेषण करें। पैरामीटर टैब में, नियंत्रण में प्रतिदीप्ति का उपयोग कर नकारात्मक और सकारात्मक आबादी के बीच अंतर करने के लिए फिल्टर डिटेक्टर तीन के वोल्टेज को 603 और फिल्टर डिटेक्टर पांच के वोल्टेज को 538 में समायोजित करें।फिर मुआवजा पर क्लिक करें, और फ़िल्टर डिटेक्टर 5 को 3 सेटअप ऑफ़सेट से एक पर सेट करें। प्राप्ति के लिए डिवाइस को कॉन्फ़िगर करने के लिए, प्रयोग चुनें, प्रयोग लेआउट चुनें और प्राप्ति को 30, 000 ईवेंट पर सेट करें. मापदंडों को समायोजित करने के बाद, लेबल किए गए नमूनों के लिए डेटा प्राप्त करें और प्रवाह साइटोमीटर में मोती होते हैं।10 मिनट के लिए 17, 949 ग्राम पर बीजाणुओं के 50 माइक्रोलीटर अपकेंद्रित्र। इसके बाद, 1-एथिल-3-3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल कार्बोडाइमाइड के 25 माइक्रोलीटर का उपयोग करके बीजाणुओं को फिर से निलंबित करें और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, बीजाणु निलंबन में 50 मिलीमोलर की एकाग्रता पर एन-हाइड्रॉक्सीसल्फोसुकिनिमाइड के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें।बीजाणु निलंबन को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बीजाणुओं को पीबीएस के साथ तीन बार सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा धोएं जैसा कि पहले दिखाया गया है। नमूनों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन जोड़ें और 15 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।1 से 50 पर पतला एथिडियम ब्रोमाइड के प्रति मिलीलीटर 10 मिलीग्राम जोड़ें, फिर प्रकाश से सुरक्षित एक घंटे के लिए बर्फ पर नमूने छोड़ दें। बीजाणुओं को धोने और फाटकों को परिभाषित करने के बाद जैसा कि पहले दिखाया गया है, x अक्ष पर फ़िल्टर डिटेक्टर तीन के लिए पैरामीटर बदलें, और डॉट प्लॉट के Y अक्ष पर फ़िल्टर डिटेक्टर पांच। गिनती मोती विधि आटोक्लेव बीजाणु नमूनों में माइक्रोलीटर प्रति तीसरे बीजाणुओं के लिए दो बार 10 का पता लगाया.आटोक्लेव बीजाणु नमूनों के एक एथिडियम ब्रोमाइड धुंधला गैर-आटोक्लेव बीजाणुओं के धुंधला होने की तुलना में उच्च औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता से पता चला, जो आनुवंशिक सामग्री के अधिक धुंधला होने का संकेत देता है। आटोक्लेव बीजाणु सतह, एपीसी लेबल के साथ मिलकर, एंटी-ह्यूमन इंटरल्यूकिन 10 एंटीबॉडी ने गैर-ऑटोक्लेव्ड बीजाणुओं की तुलना में अधिक युग्मन दक्षता दिखाई। एथिडियम ब्रोमाइड के लिए पारगम्य बीजाणुओं की उपस्थिति ने कुल आबादी में अंकुरित बीजाणुओं की संभावित उपस्थिति का संकेत दिया।प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के आधार पर, यह देखा गया कि फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी ने अंकुरित लोगों की तुलना में निष्क्रिय बीजाणुओं के साथ युग्मन का उच्च प्रतिशत दिखाया। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की एकाग्रता में वृद्धि हुई, युग्मित बीजाणुओं के प्रतिशत में वृद्धि और औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता देखी गई। प्रवाह साइटोमेट्री और बीजाणुओं की सटीक गणना के माध्यम से सटीक रीडिंग सुनिश्चित करने के लिए वर्तमान मोतियों का पूरी तरह से समरूपीकरण करना महत्वपूर्ण है।बीजाणु से जुड़े एंटीजन की एकाग्रता को मानकीकृत करते हुए, कनाडाई अध्ययन वैक्सीन एंटीबॉडी के रूप में बीजाणु के उपयोग का विश्लेषण करते हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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