Name: improvement of bacillus subtilis spore enumeration and label analysis in flow cytometry
Uploaded: 2023-06-30T12:40:00
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Este estudo foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código 001; Governo do Estado do Amazonas com recursos da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Os autores agradecem ao Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Ferramentas para a Saúde PDTIS-FIOCRUZ pela utilização de suas instalações.

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e software usados neste protocolo.
1. Configuração da citometria de fluxo
<ol><li>Alinhamento dos parâmetros ópticos do citômetro de fluxo acoplado a um computador<ol><li>Faça login no software Cytometer.</li>
		<li>No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro | Inicie e aguarde alguns minutos | Modo de limpeza | Sente...

<ol>
	<li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+endospore:+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).</li><li>Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+immobilization+of+recombinant+organophosphorus+hydrolase+on+spores+of+Bacillus+subtilis.">Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).</li><li>Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Bacillus+subtilis+spore+isolation+and+quantifying+spore+harvest+purity.">Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).</li><li>Nicholson, W. L., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation,+germination+and+outgrowth.">Sporulation, germination and outgrowth.</a> Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Mora-Uribe, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adherence+of+Clostridium+difficile+spores:+the+integrity+of+the+outermost+layer+affects+adherence+properties+of+spores+of+the+epidemic+strain+R20291+to+components+of+the+intestinal+mucosa.">Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).</li><li>Paidhungat, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ger+proteins+in+nutrient+and+nonnutrient+triggering+of+spore+germination+in+Bacillus+subtilis.">Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).</li><li>Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TruCount+absolute-count+tubes+for+determining+CD4+and+CD8+cell+numbers+in+human+immunodeficiency+virus-positive+adults.+Site+Investigators+and+The+NIAID+DAIDS+New+Technologies+Evaluation+Group.">Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).</li><li>Godfrey, A., Alsharif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+viable+spores+by+flow+cytometry.">Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry.</a> US Patent. , (2003).</li><li>Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+isolation+of+Bacillus+subtilis+spores+using+cell+sorting+and+automated+gating.">Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating.</a> PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).</li><li>Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+spore+enumeration+using+flow+cytometry:+A+proof+of+concept+for+probiotic+application.">Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application.</a> Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).</li><li>Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+permeabilization+and+activity+recovery+of+Bacillus+spores+in+adverse+conditions+for+growth.">Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth.</a> Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).</li><li>Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+bacterial+spore+germination.">Biomarkers of bacterial spore germination.</a> Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).</li><li>Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+adsorption+as+a+nonrecombinant+display+system+for+enzymes+and+antigens.">Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens.</a> Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killed+Bacillus+subtilis+spores+as+a+mucosal+adjuvant+for+an+H5N1+vaccine.">Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine.</a> Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).</li></ol>

Métodos tradicionais, como a contagem em placas de colônias, não só são demorados, como também necessitam de células viáveis e não permitem a quantificação de esporos inativados5. A câmara de Petroff-Hausser é uma metodologia alternativa, mas requer um microscopista experiente para realizá-la. A citometria de fluxo tem se mostrado uma alternativa útil para esse fim.
Genovese et al.12 descreveram o uso da citometria de fluxo para a ...

Bacillus subtilis é uma bactéria gram-positiva, em forma de bastonete, capaz de produzir esporos quiescentes quando as condições ambientais não permitem o crescimento celular1. Os esporos são formas celulares extremamente estáveis e os de várias espécies, incluindo B. subtilis, são amplamente utilizados como probióticos para uso humano e animal2. Devido às suas propriedades de resistência e segurança, o esporo de B. subtilis, que apresenta proteínas heterólogas, tem sido proposto como adjuvante da mucosa, sistema de liberação vacinal e plataforma enzimática 3,4.
Para obter esporos de B. subtilis, é necessário expô-lo à privação de nutrientes usando um meio de cultura especial. Após a obtenção e purificação desses esporos, deve-se quantificá-los para melhorar a eficiência do teste 5,6. Assim, alguns métodos são aplicados para analisar a concentração dos esporos obtidos. A contagem de placas e uma câmara de Petroff-Hausser, também conhecida como câmara de contagem, podem ser usadas. Este último foi originalmente desenvolvido para determinar a concentração de células sanguíneas; entretanto, é possível utilizá-lo no campo da microbiologia para contagem deesporos7,8. Apesar de ser o método padrão utilizado para contagem celular, a leitura é trabalhosa, pois este método é totalmente manual e sua precisão depende da experiência do operador.
Análises baseadas em citometria de fluxo (FC) têm sido previamente propostas como abordagens rápidas, confiáveis e específicas para a detecção de células marcadas de Bacillus spp. O uso de esferas de contagem por citometria de fluxo tem garantido reprodutibilidade na contagem celular em exames de rotina (contagem absoluta de linfócitos T CD4 e CD8) e no desenvolvimento de pesquisas envolvendo partículas passíveis de serem detectadas e contadas por citometria defluxo9. Godjafrey e Alsharif sugeriram o uso de contas de contagem para quantificação de CF de esporos não marcados10. O uso da citometria de fluxo foi descrito para o monitoramento da esporulação em Bacillus spp. através da marcação do DNA dos esporos 10,11,12,13. Outro estudo utilizou a CF para avaliar a quantidade de proteínas marcadas fluorescentemente na superfície dos esporos15.
Este estudo buscou utilizar esferas de contagem comerciais para garantir um padrão de reprodutibilidade em relação à contagem de eventos por citometria de fluxo. Neste trabalho, sugerimos o uso de esferas de contagem para contagem de células em FC para refinar a enumeração de esporos e avaliar a eficiência de acoplamento de anticorpos marcados fluorescentemente na superfície dos esporos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>341006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N-hydroxysuccinimide) (NHS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human fluorescent antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>501410</td>
			<td>APC anti-human IL-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse fluorescent antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td>Alexa Fluor Plus 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>&#160;BD</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)</td>
			<td>BD</td>
			<td>642412</td>
			<td>Quality control reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software v. 6.1.3</td>
			<td>BD</td>
			<td>643629</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge MegaFuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>340334</td>
			<td>TruCount Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent Microsope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Ludwig Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Microtubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improvement of bacillus subtilis spore enumeration and label analysis in flow cytometry

Os esporos de Bacillus subtilis já foram propostos para diferentes aplicações biotecnológicas e imunológicas; No entanto, há uma necessidade crescente para o desenvolvimento de metodologias que melhorem a detecção de antígenos imobilizados na superfície de esporos juntamente com sua quantificação. Análises baseadas em citometria de fluxo têm sido previamente propostas como abordagens rápidas, confiáveis e específicas para a detecção de células marcadas de B. subtilis. Neste trabalho, propomos o uso da citometria de fluxo para avaliar a eficiência de exibição de um anticorpo fluorescente (AG) na superfície do esporo e quantificar o número de esporos usando esferas de contagem. 
Para isso, utilizamos brometo de etídio como marcador de DNA e um anticorpo marcado com aloficocianina (APC), que foi acoplado aos esporos, como marcador de superfície. A quantificação dos esporos foi realizada por meio da contagem de contas, uma vez que esta técnica demonstra alta acurácia na detecção das células. Os esporos marcados foram analisados por citômetro de fluxo, que confirmou o acoplamento. Como resultado, demonstrou-se que a marcação de DNA melhorou a precisão da quantificação por citometria de fluxo, para a detecção de esporos germinados. Observou-se que o brometo de etídio não foi capaz de marcar esporos dormentes; No entanto, esta técnica fornece uma determinação mais precisa do número de esporos com proteína fluorescente acoplada à sua superfície, auxiliando assim no desenvolvimento de estudos que enfoquem o uso de esporos como plataforma biotecnológica em diferentes aplicações.

Em amostras de esporos autoclavados (AS), 2 × 103 esporos/μl e 1 ×10 3 esporos/μl foram detectados usando contagem de contas e o método de Petroff-Hausser, respectivamente (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65141/65141fig01.jpg"> Figura 1: Esquema geral de quantificação dos esporos. (A) Esporos marcados com E...

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Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

Este protocolo enfoca o uso de citometria de fluxo e contagem de esferas para quantificar esporos bacterianos marcados com brometo de etídio. O método também é eficiente para analisar o acoplamento covalente de proteínas na superfície de esporos intactos.

Aprimoramento da Enumeração de Esporos de Bacillus subtilis e Análise de Marcação em Citometria de Fluxo

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Contador celular de esporos de Bacillus subtilis usando métodos tradicionais pode ser uma tarefa trabalhosa, pois esses métodos podem ser completamente manuais e suas precisões dependendo da experiência do operador. Este protocolo possibilita a enumeração de esporos dormentes e germinativos. Além disso, a técnica também permite determinar a porcentagem de coping de proteínas fluorescentes em sua superfície.Diante da etapa de setup presente neste protocolo, a visão demonstra com as facilidades e o entendimento técnico e o detalhamento do cuidado nesta execução. Comece fazendo login no software do citômetro. No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro, seguido por Inicialização fluídica.Em seguida, escolha Modos de limpeza. E, finalmente, inicie o SIT Flush. Tomar 50 microlitros de esporos de autoclave e incubá-los com brometo de etídio a um fator de diluição de 0,05% volume em volume por 30 minutos protegidos da luz.Lave os esporos três vezes com PBS centrifugando a 17, 949 G por 10 minutos e ressuspendendo em PBS. Em seguida, adicione 10 microlitros de contas seguindo as recomendações do fabricante para diluição e analise a amostra usando um citômetro de fluxo. Definir a estratégia de gating com base nas características morfométricas e de fluorescência das partículas usando o controle negativo como referência.Em seguida, misture o tubo suavemente. Anexe-o à sonda do citômetro de fluxo e clique em Adquirir. Para definir a potência do laser, vá para a guia de parâmetros na janela do citômetro, ajuste a dispersão para frente para 375 e a dispersão lateral para 275.Em seguida, selecione a guia limite e defina-a como 500. Em seguida, analise a amostra sem corante contendo apenas esporos para eliminar a autofluorescência. Na guia de parâmetros, ajuste as tensões do detector de filtro três para 603 e as tensões do detector de filtro cinco para 538 para diferenciar entre populações negativas e positivas usando fluorescência nos controles.Em seguida, clique em Compensação e defina o deslocamento de configuração do detector de filtro 5 por 3 como um. Para configurar o dispositivo para aquisição, selecione Experimentar, escolha o layout do experimento e defina a aquisição como 30.000 eventos. Após o ajuste dos parâmetros, adquira dados para as amostras que são rotuladas e contêm contas no citômetro de fluxo.Centrifugar 50 microlitros de esporos a 17, 949 G por 10 minutos. Em seguida, ressuspender os esporos usando 25 microlitros de carbodiimida 1-etil-3-3-dimetilaminopropil e incubar por 15 minutos. Em seguida, adicionar 25 microlitros de N-hidroxisulfosuccinimida a uma concentração de 50 milimolares à suspensão de esporos.Incubar a suspensão de esporos à temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave os esporos três vezes com PBS centrifugando, como mostrado anteriormente. Adicione proteína fluorescente às amostras e incube durante a noite a 15 graus Celsius.Adicione 10 miligramas por mililitro de brometo de etídio diluído de 1 a 50 e, em seguida, deixe as amostras no gelo por uma hora, protegidas da luz. Depois de lavar os esporos e definir as comportas como mostrado anteriormente, altere os parâmetros para o detector de filtro três no eixo x e detector de filtro cinco no eixo Y do gráfico de pontos. O método de contagem de esferas detectou duas vezes 10 a terceiro esporos por microlitro em amostras de esporos em autoclave.A coloração com brometo de etídio nas amostras de esporos em autoclave mostrou maior intensidade média de fluorescência do que a coloração com esporos não autoclavados, indicando maior coloração do material genético. A superfície do esporo da autoclave, juntamente com o anticorpo antileucina 10 marcado com APC, apresentou maior eficiência de acoplamento em relação aos esporos não autoclavados. A presença de esporos permeáveis ao brometo de etídio indicou a possível presença de esporos germinados na população total.Com base nas análises por citometria de fluxo, observou-se que o anticorpo fluorescente apresentou maior porcentagem de acoplamento com os esporos dormentes em comparação aos germinados. Além disso, à medida que a concentração de anticorpos fluorescentes aumentou, observou-se um aumento na porcentagem de esporos acoplados e na intensidade média da fluorescência. É importante realizar uma homogeneização completa das esferas atuais para garantir leituras precisas através de citometria de fluxo e enumeração precisa de esporos.Padronizando a concentração de antígenos ligados ao esporos, estudos canadenses analisam o uso de esporos como anticorpos vacinais.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

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The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Bioquímica

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Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

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Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

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Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

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Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo

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