Name: improvement of bacillus subtilis spore enumeration and label analysis in flow cytometry
Uploaded: 2023-06-30T12:40:00
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Este estudio fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código de Finanzas 001; Governo do Estado do Amazonas con recursos de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq). Los autores agradecen al Programa de Desarrollo Tecnológico en Herramientas para la Salud PDTIS-FIOCRUZ por el uso de sus instalaciones.

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y software utilizados en este protocolo.
1. Configuración de citometría de flujo
<ol><li>Alineación de los parámetros ópticos de un citómetro de flujo acoplado a un ordenador<ol><li>Inicie sesión en el software Cytometer.</li>
		<li>En el espacio de trabajo de software, seleccione Citómetro | Inicie y espere unos minutos ...

<ol>
	<li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+endospore:+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).</li><li>Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+immobilization+of+recombinant+organophosphorus+hydrolase+on+spores+of+Bacillus+subtilis.">Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).</li><li>Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Bacillus+subtilis+spore+isolation+and+quantifying+spore+harvest+purity.">Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).</li><li>Nicholson, W. L., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation,+germination+and+outgrowth.">Sporulation, germination and outgrowth.</a> Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Mora-Uribe, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adherence+of+Clostridium+difficile+spores:+the+integrity+of+the+outermost+layer+affects+adherence+properties+of+spores+of+the+epidemic+strain+R20291+to+components+of+the+intestinal+mucosa.">Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).</li><li>Paidhungat, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ger+proteins+in+nutrient+and+nonnutrient+triggering+of+spore+germination+in+Bacillus+subtilis.">Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).</li><li>Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TruCount+absolute-count+tubes+for+determining+CD4+and+CD8+cell+numbers+in+human+immunodeficiency+virus-positive+adults.+Site+Investigators+and+The+NIAID+DAIDS+New+Technologies+Evaluation+Group.">Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).</li><li>Godfrey, A., Alsharif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+viable+spores+by+flow+cytometry.">Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry.</a> US Patent. , (2003).</li><li>Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+isolation+of+Bacillus+subtilis+spores+using+cell+sorting+and+automated+gating.">Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating.</a> PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).</li><li>Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+spore+enumeration+using+flow+cytometry:+A+proof+of+concept+for+probiotic+application.">Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application.</a> Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).</li><li>Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+permeabilization+and+activity+recovery+of+Bacillus+spores+in+adverse+conditions+for+growth.">Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth.</a> Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).</li><li>Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+bacterial+spore+germination.">Biomarkers of bacterial spore germination.</a> Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).</li><li>Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+adsorption+as+a+nonrecombinant+display+system+for+enzymes+and+antigens.">Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens.</a> Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killed+Bacillus+subtilis+spores+as+a+mucosal+adjuvant+for+an+H5N1+vaccine.">Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine.</a> Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).</li></ol>

Los métodos tradicionales, como el recuento en placa de las colonias, no solo consumen mucho tiempo, sino que también necesitan células viables y no permiten la cuantificación de esporas inactivadas5. La cámara de Petroff-Hausser es una metodología alternativa, pero requiere de un microscopista experimentado para realizarla. La citometría de flujo ha demostrado ser una alternativa útil para este propósito.
Genovese et al.12 describieron ...

Bacillus subtilis es una bacteria grampositiva en forma de bastoncillo que es capaz de producir esporas quiescentes cuando las condiciones ambientales no permiten el crecimiento celular1. Las esporas son formas celulares extremadamente estables y las de varias especies, incluida B. subtilis, se utilizan ampliamente como probióticos para uso humano y animal2. Debido a sus propiedades de resistencia y seguridad, la espora de B. subtilis, que presenta proteínas heterólogas, ha sido propuesta como adyuvante de la mucosa, sistema de administración de vacunas y plataforma de inmovilización enzimática 3,4.
Para obtener esporas de B. subtilis, es necesario exponerlo a la privación de nutrientes utilizando un medio de cultivo especial. Después de obtener y purificar estas esporas, se deben cuantificar para mejorar la eficiencia de la prueba 5,6. Así, se aplican ciertos métodos para analizar la concentración de las esporas obtenidas. Se puede utilizar el conteo de placas y una cámara de Petroff-Hausser, también conocida como cámara de conteo. Este último se desarrolló originalmente para determinar la concentración de células sanguíneas; sin embargo, es posible utilizarlo en el campo de la microbiología para el recuento de esporas 7,8. A pesar de ser el método estándar utilizado para el conteo de células, la lectura es laboriosa ya que este método es completamente manual y su precisión depende de la experiencia del operador.
Los análisis basados en citometría de flujo (FC) se han propuesto previamente como enfoques rápidos, confiables y específicos para detectar células marcadas de Bacillus spp. El uso de perlas de recuento por citometría de flujo ha garantizado la reproducibilidad en el recuento celular, en los exámenes rutinarios (recuento absoluto de linfocitos T CD4 y CD8) y en el desarrollo de investigaciones con partículas capaces de ser detectadas y contadas mediante citometría de flujo9. Godjafrey y Alsharif sugirieron el uso de perlas de conteo para la cuantificación de FC de esporas no marcadas10. Se describió el uso de citometría de flujo para el monitoreo de la esporulación en Bacillus spp. a través del marcaje del ADN de las esporas 10,11,12,13. Otro estudio utilizó FC para evaluar la cantidad de proteínas marcadas con fluorescencia en la superficie de las esporas15.
Este estudio buscó utilizar perlas de conteo comerciales para asegurar un estándar de reproducibilidad con respecto al conteo de eventos mediante citometría de flujo. En este artículo, sugerimos el uso de perlas de recuento para el recuento de células en FC para refinar la enumeración de esporas y evaluar la eficiencia de acoplamiento de anticuerpos marcados con fluorescencia en la superficie de las esporas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>341006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N-hydroxysuccinimide) (NHS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human fluorescent antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>501410</td>
			<td>APC anti-human IL-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse fluorescent antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td>Alexa Fluor Plus 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>&#160;BD</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)</td>
			<td>BD</td>
			<td>642412</td>
			<td>Quality control reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software v. 6.1.3</td>
			<td>BD</td>
			<td>643629</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge MegaFuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>340334</td>
			<td>TruCount Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent Microsope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Ludwig Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Microtubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improvement of bacillus subtilis spore enumeration and label analysis in flow cytometry

Las esporas de Bacillus subtilis ya han sido propuestas para diferentes aplicaciones biotecnológicas e inmunológicas; Sin embargo, cada vez es más necesario desarrollar metodologías que mejoren la detección de antígenos inmovilizados en la superficie de las esporas junto con su cuantificación. Los análisis basados en citometría de flujo se han propuesto previamente como enfoques rápidos, fiables y específicos para detectar células marcadas de B. subtilis. En este trabajo, proponemos el uso de la citometría de flujo para evaluar la eficiencia de visualización de un anticuerpo fluorescente (AF) en la superficie de la espora y cuantificar el número de esporas mediante perlas de recuento. 
Para ello, utilizamos bromuro de etidio como marcador de ADN y un anticuerpo marcado con aloficocianina (APC), que se acopló a las esporas, como marcador de superficie. La cuantificación de las esporas se realizó mediante perlas de conteo, ya que esta técnica demuestra una alta precisión en la detección de células. Las esporas marcadas se analizaron con un citómetro de flujo, lo que confirmó el acoplamiento. Como resultado, se demostró que el marcaje de ADN mejoró la precisión de la cuantificación por citometría de flujo, para la detección de esporas germinadas. Se observó que el bromuro de etidio no era capaz de marcar las esporas latentes; Sin embargo, esta técnica proporciona una determinación más precisa del número de esporas con proteína fluorescente acoplada a su superficie, lo que ayuda en el desarrollo de estudios que se centran en el uso de esporas como plataforma biotecnológica en diferentes aplicaciones.

En muestras de esporas (AS) esterilizadas en autoclave, se detectaron 2 × 103 esporas/μl y 1 × 103 esporas/μl mediante el uso de perlas de recuento y el método de Petroff-Hausser, respectivamente (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65141/65141fig01.jpg"> Figura 1: Esquema general de cuantificación de esporas. (A</strong...

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Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

Este protocolo se centra en el uso de citometría de flujo y perlas de recuento para cuantificar las esporas bacterianas marcadas con bromuro de etidio. El método también es eficiente para analizar el acoplamiento covalente de proteínas en la superficie de esporas intactas.

Mejora de la enumeración de esporas de Bacillus subtilis y el análisis de etiquetas en citometría de flujo

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

El contador celular de esporas de Bacillus subtilis mediante métodos tradicionales puede ser una tarea laboriosa, ya que estos métodos pueden ser completamente manuales y sus precisiones dependen de la experiencia del operador. Este protocolo hace posible la enumeración de esporas latentes y germinativas. Además, la técnica también permite determinar el porcentaje de cofia de proteínas fluorescentes en su superficie.Dado el paso de configuración presente en este protocolo, la visión se demuestra con las instalaciones y la comprensión técnica y el detalle del cuidado en esta ejecución. Comience iniciando sesión en el software del citómetro. En el espacio de trabajo de software, seleccione Citómetro y, a continuación, Inicio fluídico.A continuación, elija Modos de limpieza. Y, por último, inicie SIT Flush. Tomar 50 microlitros de esporas de autoclave e incubarlas con bromuro de etidio a un factor de dilución de 0,05% volumen por volumen durante 30 minutos protegidos de la luz.Lavar las esporas tres veces con PBS centrifugando a 17,949 G durante 10 minutos y volviendo a suspender en PBS. A continuación, agregue 10 microlitros de perlas siguiendo las recomendaciones del fabricante para la dilución y analice la muestra con un citómetro de flujo. Definir la estrategia de compuerta en función de las características morfométricas y de fluorescencia de las partículas utilizando como referencia el control negativo.A continuación, mezcle el tubo suavemente. Conéctelo a la sonda del citómetro de flujo y haga clic en Adquirir. Para configurar la potencia del láser, vaya a la pestaña de parámetros en la ventana del citómetro, ajuste la dispersión frontal a 375 y la dispersión lateral a 275.A continuación, seleccione la pestaña de umbral y configúrela en 500. A continuación, analice la muestra sin colorante que contiene solo esporas para eliminar la autofluorescencia. En la pestaña de parámetros, ajuste los voltajes del detector de filtro tres a 603 y los voltajes del detector de filtro cinco a 538 para diferenciar entre poblaciones negativas y positivas utilizando fluorescencia en los controles.A continuación, haga clic en Compensación y establezca el desplazamiento de configuración del detector de filtro de 5 por 3 en uno. Para configurar el dispositivo para la adquisición, seleccione Experimento, elija el diseño del experimento y establezca la adquisición en 30.000 eventos. Después de ajustar los parámetros, adquiera datos para las muestras que están etiquetadas y contienen perlas en el citómetro de flujo.Centrifugar 50 microlitros de esporas a 17.949 G durante 10 minutos. A continuación, vuelva a suspender las esporas con 25 microlitros de 1-etil-3-3-dimetilaminopropilcarbodiimida e incube durante 15 minutos. Posteriormente, agregue 25 microlitros de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de 50 milimolares a la suspensión de esporas.Incuba la suspensión de esporas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave las esporas tres veces con PBS centrifugando como se muestra anteriormente. Agregue proteína fluorescente a las muestras e incube durante la noche a 15 grados centígrados.Agregue 10 miligramos por mililitro de bromuro de etidio diluido de 1 a 50, luego deje las muestras en hielo durante una hora, protegidas de la luz. Después de lavar las esporas y definir las puertas como se muestra anteriormente, cambie los parámetros para el detector de filtro tres en el eje x y el detector de filtro cinco en el eje Y del diagrama de puntos. El método de conteo de perlas detectó dos veces 10 a la tercera esporas por microlitro en muestras de esporas de autoclave.Una tinción con bromuro de etidio de muestras de esporas de autoclave mostró una mayor intensidad de fluorescencia media que la tinción de esporas no esterilizadas en autoclave, lo que indica una mayor tinción de material genético. La superficie de las esporas del autoclave, junto con el anticuerpo anti-interleucina 10 humana marcado con APC, mostró una mayor eficiencia de acoplamiento en comparación con las esporas no esterilizadas en autoclave. La presencia de esporas permeables al bromuro de etidio indicó la posible presencia de esporas germinadas en la población total.Con base en los análisis de citometría de flujo, se observó que el anticuerpo fluorescente mostró un mayor porcentaje de acoplamiento con las esporas latentes en comparación con las germinadas. Además, a medida que aumentaba la concentración de anticuerpos fluorescentes, se observaba un aumento en el porcentaje de esporas acopladas y en la intensidad media de fluorescencia. Es importante realizar una homogeneización exhaustiva de las perlas de corriente para garantizar lecturas precisas a través de la citometría de flujo y la enumeración precisa de las esporas.Estandarizando la concentración de antígenos adheridos a la espora, los estudios canadienses analizan el uso de esporas como anticuerpos de la vacuna.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identificación de los ácidos grasos en la<em&gt; Bacillus cereus</em

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Investigación

Bioquímica

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Expresión de Proteínas Recombinantes, Cristalización y Estudios Biofísicos de un<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleótido Pirofosforilasa, BcMazG

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