Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health (R37 HL-64159).

1. Transformation, ekspression og oprensning af stilladsproteinkomponent
<ol><li>BL21 bakteriel transformation med apoE4-NT indeholdende plasmid<ol><li>Optø et rør BL21 (DE3) kompetente celler på is i 10 min.</li>
		<li>Når al isen er smeltet, blandes forsigtigt og forsigtigt 50 μL af cellerne i et transformationsrør på is.</li>
		<li>Der tilsættes 5 μL indeholdende 50 ng plasmid-DNA (for sekvens, se supplerende tabel 1) til celleblandingen. Svip forsigtigt røret fire eller f...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

Formulering af et bioaktivt middel indeholdende nanodisketter giver en bekvem metode til at opløse ellers uopløselige hydrofobe forbindelser. Da produktet bioaktive stof nanodisketter er fuldt opløselige i vandige medier, giver de en nyttig leveringsmetode for en lang række hydrofobe molekyler (tabel 1). Disse omfatter små molekyler, naturlige og syntetiske stoffer, phytonutrients, hormoner osv. Formuleringsstrategien følger normalt en standardprotokol, der skal tage hensyn til opløselighedsegensk...

Spirende discoidale lipoproteiner med høj densitet (HDL'er) er naturligt forekommende forfædre til den langt mere rigelige sfæriske HDL, der findes i det menneskelige kredsløbssystem. Disse spirende partikler, også kaldet pre-ß HDL, besidder unikke og karakteristiske strukturelle egenskaber1. Faktisk, snarere end at eksistere som en sfærisk partikel, spirende HDL'er er skiveformede. Omfattende strukturelle karakteriseringsundersøgelser af naturlige og rekonstituerede diskoide HDL'er har afsløret, at de består af et phospholipid-dobbeltlag, hvis omkreds er omskrevet af et amfipatisk udskifteligt apolipoprotein (apo), såsom apoA-I. I human lipoproteinmetabolisme akkumulerer cirkulerende spirende HDL'er lipider fra perifere celler og modnes til sfæriske HDL'er i en proces, der er afhængig af nøgleproteinmediatorer, herunder ATP-bindende kassettetransportør A1 og lecithin: kolesterolacyltransferse2. Denne proces repræsenterer en kritisk komponent i den omvendte kolesteroltransportvej, der anses for at være beskyttende mod hjertesygdomme. Bevæbnet med denne viden og evnen til at rekonstituere diskoide HDL'er har forskere anvendt disse partikler som en terapeutisk intervention til behandling af aterosklerose3. I det væsentlige fremmer infusionen af rekonstitueret HDL (rHDL) til patienter kolesteroludstrømning fra plakaflejringer og returnerer det til leveren til omdannelse til galdesyrer og udskillelse fra kroppen. Flere bioteknologi-/medicinalvirksomheder følger denne behandlingsstrategi4.
Samtidig har evnen til at generere disse partikler i laboratoriet udløst en byge af forskningsaktiviteter, der har ført til nye applikationer og nye teknologier. En fremtrædende anvendelse involverer brugen af rHDL-partikler som en miniaturemembran til at huse transmembranproteiner i et naturligt lignende miljø5. Til dato er hundredvis af proteiner med succes blevet inkorporeret i discoidal rHDL, og forskning har vist, at disse proteiner bevarer både native konformation og biologisk aktivitet som receptorer, enzymer, transportører osv. Disse partikler, kaldet "nanodiske", har også vist sig at være modtagelige for strukturel karakterisering, ofte ved høj opløsning6. Denne tilgang til undersøgelser af transmembranproteiner anerkendes som overlegen i forhold til undersøgelser med vaskemiddelmiceller eller liposomer og skrider derfor hurtigt frem. Det er vigtigt at erkende, at to forskellige metoder er blevet rapporteret, der er i stand til at danne en rHDL. "Cholatdialyse" metode13 er populær til applikationer relateret til inkorporering af transmembranproteiner i rHDL dobbeltlag5. I det væsentlige involverer denne formuleringsmetode blanding af et dobbeltlag, der danner phospholipid, et stilladsprotein og transmembranproteinet af interesse i en buffer indeholdende vaskemidlet natriumcholat (eller natriumdeoxycholat; micellemolekylvægt [MW] på 4.200 Da). Vaskemidlet opløser effektivt de forskellige reaktionskomponenter, hvilket gør det muligt at dialysere prøven mod buffer, der mangler vaskemiddel. Under dialysetrinnet, når vaskemidlet fjernes fra prøven, dannes der spontant en rHDL. Når denne fremgangsmåde bruges til at fange et transmembranprotein af interesse, er produktpartiklerne blevet kaldt nanodiske5. Forsøg på at bruge denne metode til at inkorporere små molekyler hydrofobe bioaktive stoffer (MW <1.000 Da) har imidlertid stort set været mislykkede. I modsætning til transmembranproteiner er bioaktive stoffer med små molekyler i stand til at flygte fra dialyseposen sammen med vaskemidlet, hvilket i høj grad reducerer deres inkorporeringseffektivitet i rHDL'er. Dette problem blev løst ved at udelade vaskemidler fra formuleringsblandingen14. I stedet tilsættes komponenterne til en vandig buffer sekventielt, begyndende med det dobbeltlag, der danner lipid, der danner et stabilt bioaktivt middel indeholdende rHDL, kaldet en nanodisk. Andre har anvendt rHDL til inkorporering og transport af in vivo-billeddannelsesmidler 7. For nylig er specialiseret rHDL bestående af et apolipoproteinstillads og det anioniske glycerophospholipid, cardiolipin, blevet anvendt i ligandbindingsundersøgelser. Disse partikler giver en platform for undersøgelser af interaktionen mellem cardiolipin og forskellige vandopløselige ligander, herunder calcium, cytokrom c og anticancermidlet doxorubicin8.
Fokus for denne undersøgelse er på formuleringen af rHDL, der besidder et stabilt inkorporeret hydrofob bioaktivt middel (dvs. nanodiskette). Disse midlers evne til at integrere sig i lipidmiljøet af discoidale rHDL-partikler giver dem effektivt vandig opløselighed. Som sådan har nanodisketter potentiale til in vivo-terapeutiske anvendelser. Ved formulering af nanodisketter kræves der specifikke inkubations-/reaktionsbetingelser for at kunne inkorporere diskrete hydrofobe bioaktive stoffer i produktpartiklen, og målet med denne rapport er at give detaljerede praktiske oplysninger, der kan bruges som en grundlæggende skabelon til oprettelse af nye nanodiskpartikler til specifikke anvendelser. I forbindelse med dette manuskript er udtrykkene nanodisk og nanodisk således ikke udskiftelige. Mens nanodisc refererer til en rHDL formuleret til at indeholde et transmembranprotein indlejret i dets lipiddobbeltlag5, henviser udtrykket nanodisk til en rHDL formuleret til at inkorporere hydrofobe bioaktive stoffer med lav molekylvægt (< 1.000 Da), såsom amphotericin B14.
En række forskellige metoder er tilgængelige til erhvervelse af egnede stilladsproteiner. Det er muligt at købe stilladsproteiner fra producenter [f.eks. apoA-I (SRP4693) eller apoE4 (A3234)], men omkostningerne kan være en begrænsende faktor. En foretrukken tilgang er at udtrykke rekombinante stilladsproteiner i Escherichia coli. Protokoller offentliggøres for human apoA-I9, apoE410 samt insekthæmolympproteinet apolipophorin-III11. Til de her beskrevne eksperimenter blev rekombinant humant apoE4 N-terminalt (NT) domæne (aminosyrer 1-183) anvendt. Nukleotidsekvensen, der koder for human apoE4-NT, blev syntetiseret og indsat i en pET-22b (+) ekspressionsvektor direkte ved siden af den vektorkodede pelB-ledersekvens. Denne konstruktion fører til ekspression af et pelB-ledersekvens-apoE4-NT fusionsprotein. Efter proteinsyntese leder den bakterielle pelB-ledersekvens det nyligt syntetiserede protein til det periplasmatiske rum, hvor lederpeptidase spalter pelB-sekvensen. Det resulterende apoE4-NT-protein uden sekvensmærker eller haler undslipper efterfølgende bakterierne og akkumuleres i dyrkningsmediet11,12, hvilket forenkler downstream-behandlingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

Udtrykket nanodisk refererer til en diskret type nanopartikel bestående af et dobbeltlag, der danner lipid, et stilladsprotein og et integreret bioaktivt middel. Nanodisketter er organiseret som et diskformet lipiddobbeltlag, hvis omkreds er afgrænset af stilladsproteinet, normalt et medlem af den udskiftelige apolipoproteinfamilie. Talrige hydrofobe bioaktive stoffer er blevet effektivt opløseligt i nanodisketter ved deres integration i det hydrofobe miljø af partiklens lipiddobbeltlag, hvilket giver en stort set homogen population af partikler i området 10-20 nm i diameter. Formuleringen af nanodisketter kræver et præcist forhold mellem individuelle komponenter, en passende sekventiel tilsætning af hver komponent efterfulgt af badsonikering af formuleringsblandingen. Det amfipatiske stilladsprotein kontakter og omorganiserer spontant det dispergerede dobbeltlag, der danner lipid / bioaktivt middelblanding for at danne en diskret, homogen population af nanodiskpartikler. Under denne proces overgår reaktionsblandingen fra et uigennemsigtigt, uklart udseende til en klaret prøve, der, når den er fuldt optimeret, ikke giver noget bundfald ved centrifugering. Karakteriseringsundersøgelser involverer bestemmelse af bioaktivt middelopløselighedseffektivitet, elektronmikroskopi, gelfiltreringskromatografi, ultraviolet synlig (UV / Vis) absorbansspektroskopi og / eller fluorescensspektroskopi. Dette efterfølges normalt af en undersøgelse af biologisk aktivitet ved hjælp af dyrkede celler eller mus. I tilfælde af nanodisketter, der indeholder et antibiotikum (dvs. makrolidpolyenantibiotikumet amphotericin B), kan deres evne til at hæmme væksten af gær eller svampe som funktion af koncentration eller tid måles. Den relative lette formulering, alsidighed med hensyn til komponenter, nanoskala partikelstørrelse, iboende stabilitet og vandig opløselighed tillader utallige in vitro og in vivo anvendelser af nanodiskteknologi. I denne artikel beskriver vi en generel metode til at formulere og karakterisere nanodisketter indeholdende amphotericin B som det hydrofobe bioaktive middel.

Bioaktivt middel nanodisk formulering proces I den beskrevne ampB-nanodiskformuleringsprocedure betragtes reaktionen som fuldstændig, når prøvens udseende overgår fra uklar til klar (figur 1). Denne ændring indikerer, at nanodisketter er dannet, og at det bioaktive middel er blevet opløseligt. Ofte absorberer bioaktive stoffer lys i det synlige bølgelængdeområde (fx ampB, curcumin, lutein, coenzym Q10), og i disse tilfælde vedtager prøven farven på ...

Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Her beskriver vi produktion og karakterisering af bioaktive stoffer indeholdende nanodisketter. Amphotericin B nanodisketter tages som et eksempel for at beskrive protokollen trinvis.

Formulering og karakterisering af bioaktivt stof indeholdende nanodiske

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Denne protokol giver praktisk viden, der er nyttig til formulering af nanoskalapartikler, dvs. nanodisketter, der stabilt inkorporerer en bred vifte af hydrofobe bioaktive molekyler. Denne metode har mange praktiske anvendelser.Evnen til at give vandig opløselighed til ellers uopløselige bioaktive forbindelser gør det muligt at anvende nanodisketter i lægemiddelafgivelsesapplikationer. Den beskrevne metode er ligetil. Det foretrækkes at gennemføre undersøgelser i den beskrevne skala, fem milligram phospholipid, to milligram stilladsprotein, således at dannelsen af nanodisketter let overvåges ved visuel inspektion.Demonstrere proceduren vil være Michael Karo og Matthew Swackhammer, bachelorstuderende forskere i Ryan lab. For at forberede en phospholipidalikvote vejes fem milligram DMPC og overføres til et glas reagensglas. Opløs phospholipidet ved at tilsætte 300 mikroliter chloroform og 100 mikroliter methanol i et forhold på tre til en.Det organiske opløsningsmiddel inddampes ved at anbringe reagensglasset under en mild strøm af nitrogengas i 10 til 15 minutter, således at der dannes en tynd film af tørret phospholipid langs væggene i rørets nederste del. For at formulere amphotericin B eller AmpB-nanodiske, pipette 450 mikroliter PBS til den frysetørrede phospholipid alikvote og hvirvel i 30 sekunder for at sprede lipidet. Der pipetteres 50 mikroliter 20 milligram pr. milliliter stamopløsning i den dispergerede phospholipidprøve og hvirvel.Tilsæt 500 mikroliter fire milligram pr. milliliter ApoE4 NT stilladsprotein til glasset reagensglas indeholdende det dispergerede phospholipid og AmpB. Bad sonikere prøven ved 24 grader Celsius, indtil opløsningen afklarer. Til AmpB-nanodisk dialyse skal du forberede en sektion af dialyseslangen ved grundigt at lægge den i blød i destilleret deioniseret vand i 10 minutter.Brug en dialyseslangeklemme til at klemme den ene ende af den gennemblødte dialyseslange, og sørg for, at ingen væske kan slippe ud. Indsæt en smal halstragt i den åbne ende af dialyseslangen, og overfør AmpB-Nanodiskprøven til dialyseslangen. Fjern tragten, og klem enden af dialyseslangen med en anden dialyserørklemme.Anbring en skumdialyseflåd på en af de forseglede ender af dialyseslangen, og anbring den samlede dialyseslange i bægerglasset, der indeholder frisklavet en liter PBS-buffer. Anbring en magnetisk omrøringsstang i bunden af bægerglasset, og juster omrøringskontrollen til lav, så der ikke dannes en hvirvelstrøm. Lad dialysen fortsætte natten over ved fire grader Celsius.Tænd spektrofotometeret ved at dreje på afbryderen, og opret forbindelse til en tilsvarende supportcomputer ved at trykke på pc-styringen. På supportcomputeren skal du åbne softwaren mærket UVProbe 2.61 og oprette forbindelse til spektrofotometeret ved at klikke på tilslut "i nederste venstre hjørne. Klik på spektret, og klik derefter på metode"i den øverste værktøjslinje.Klik på målefanen og indtast 500 i starttekstfeltet placeret under bølgelængdeområde og 300 i slutningen"tekstboks. Klik på rullemenuen ved siden af fanen mærket scanningshastighed"og indstil den til medium. Forbered en prøve blindprøve ved at overføre en milliliter DMSO til to kvarts kuvetter.Begge kuvetter anbringes i spektrofotometerets respektive prøveporte. Klik automatisk tom"og optag et spektrum fra 300 til 500 nanometer ved at klikke på start"i nederste venstre hjørne. Til AmpB-standardspektralanalyse fjernes kuvetten fra den forreste prøveport, og der tilsættes 20 mikroliter et milligram pr. milliliter AmpB-stamopløsning.Læg kuvetten tilbage i prøvepladen, og klik på start" for at registrere prøveabsorbansen. Efter registrering af prøveabsorbansen fjernes kuvetten, og væskeindholdet dekanteres i en affaldsbeholder. Skyl kuvetten grundigt med tre vaske deioniseret vand efterfulgt af tre vaske med 70% ethanol.Til spektralanalyse af forstyrret AmpB-Nanodisk fremstilles prøven ved pipettering af 20 mikroliter et milligram pr. milliliter AmpB-Nanodisk-lager til en milliliter DMSO og inkuberes i et minut, før spektret registreres. Læg kuvetten i den forreste prøveport, og klik på start" for at registrere prøveabsorbansen. Til spektralanalyse af et PBS-bufferemne fremstilles en blindprøve ved at overføre en milliliter PBS til to kvartskuvetter.Læg kuvetterne i prøveporten. Klik automatisk tom"og optag spektret fra 300 til 500 nanometer. Til spektralanalyse af en ikke-forstyrret AmpB-Nanodisk-prøve fjernes kuvetten fra den forreste prøveport, og der tilsættes 20 mikroliter af en milligram pr. milliliter AmpB-Nanodisk-prøve i PBS-bufferen.Læg kuvetten tilbage i prøvebrættet. Klik på start"og optag prøvespektret. AmpB-Nanodisk-formuleringsreaktionen betragtes som komplet, når prøvens udseende overgår fra uklar til klar.UV synlig absorptionsspektroskopi af AmpB prøver i DMSO og PBS er vist. I DMSO blev der observeret tre karakteristiske absorbansmaksima ved 372, 392 og 415 nanometer, toppe, der indikerer AmpB. Absorbansspektrene for AmpB-nanodiske i PBS viste en enkelt større absorbanstop ved en kortere bølgelængde.Til sammenligning lignede absorbansspektrene for AmpB-nanodiske i DMSO spektrene for lager AmpB. Biologisk aktivitet af AmpB-nanodiske blev udført ved at vurdere gærvæksthæmningsassays. Kontrolprøver som PBS, DMSO og rekonstituerede lipoproteiner med høj densitet viste, at andre nanodiskkomponenter end AmpB ikke har nogen mærkbar effekt på gærvækst.Den positive kontrol bekræftede, at AmpB er en effektiv hæmmer af gærvækst. For AmpB-nanodiske blev koncentrationsafhængig væksthæmningsaktivitet observeret. Ikke alle nanodiskpræparater er ens.Nogle kan kræve mere tid, forskellige lipider eller forskellige stilladsproteiner. De er kun utydelige} er afklaringen af nanodiskprøven. Denne teknik har ført til nye nanopartikler, der anvendes til at studere Doxorubicin-induceret kardiotoksicitet, apoptose, ligandinteraktioner og leveret adskillige vandige uopløselige bioaktive molekyler, herunder lutein og curcumin.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinere våd og tør Lab Techniques Guide krystallisering af store coiled-coil indeholdende proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturel karakterisering af Mannan cellevæg polysaccharider i anlaeg, der anvender PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Samtidig måling af superoxid/Hydrogen Peroxid og NADH produktion af Flavin-holdige mitokondrie Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Funktionelle karakterisering af Carboxylesterases i insekticid resistente stuefluer, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Fuldt autonome karakterisering og indsamling af Data fra krystaller af biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Brug af Alu Element, der indeholder Minigenes til at analysere cirkulære RNA'er

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering af membran transportører ved heterologe udtryk i E. coli og fremstilling af membran vesikler

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...