Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (R37 HL-64159).

1. Transformatie, expressie en zuivering van steigereiwitcomponent
<ol><li>BL21 bacteriële transformatie met apoE4-NT bevattend plasmide<ol><li>Ontdooi een buisje BL21 (DE3) competente cellen op ijs gedurende 10 min.</li>
		<li>Zodra al het ijs is gesmolten, mengt u voorzichtig en voorzichtig pipet 50 μL van de cellen in een transformatiebuis op ijs.</li>
		<li>Voeg 5 μL met 50 ng plasmide-DNA (voor sequentie, zie aanvullende tabel 1) toe aan het celmengsel. Veeg voorzichtig vier of...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

Formulering van een bioactief middel dat nanoschijven bevat, biedt een handige methode om anders onoplosbare hydrofobe verbindingen op te lossen. Omdat de nanoschijven van het bioactieve middel van het product volledig oplosbaar zijn in waterige media, bieden ze een nuttige toedieningsmethode voor een breed scala aan hydrofobe moleculen (tabel 1). Deze omvatten kleine moleculen, natuurlijke en synthetische drugs, fytonutriënten, hormonen, enz. De formuleringsstrategie volgt meestal een standaardprotocol...

Ontluikende discoïdale lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL's) zijn van nature voorkomende voorlopers van het veel overvloedigere bolvormige HDL dat aanwezig is in de menselijke bloedsomloop. Deze ontluikende deeltjes, ook wel pre-ß HDL genoemd, bezitten unieke en onderscheidende structurele eigenschappen1. Inderdaad, in plaats van te bestaan als een sferoïdaal deeltje, zijn ontluikende HDL's schijfvormig. Uitgebreide structurele karakteriseringsstudies op natuurlijke en gereconstitueerde discoïdale HDLs hebben aangetoond dat ze bestaan uit een fosfolipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door een amfipathisch uitwisselbaar apolipoproteïne (apo), zoals apoA-I. In het metabolisme van menselijke lipoproteïneën bouwen circulerende ontluikende HDL's lipiden op uit perifere cellen en rijpen ze tot bolvormige HDLs in een proces dat afhankelijk is van belangrijke eiwitmediatoren, waaronder de ATP-bindingscassettetransporter A1 en lecithine: cholesterolacyltransferse2. Dit proces vertegenwoordigt een cruciaal onderdeel van de omgekeerde cholesteroltransportroute die wordt beschouwd als beschermend tegen hartaandoeningen. Gewapend met deze kennis en het vermogen om discoïdale HDLs te reconstitueren, hebben onderzoekers deze deeltjes gebruikt als een therapeutische interventie om atherosclerose3 te behandelen. In wezen bevordert de infusie van gereconstitueerd HDL (rHDL) bij patiënten cholesterolefflux uit plaqueafzettingen en brengt het terug naar de lever voor omzetting in galzuren en uitscheiding uit het lichaam. Verschillende biotechnologie/farmaceutische bedrijven volgen deze behandelingsstrategie4.
Tegelijkertijd heeft het vermogen om deze deeltjes in het laboratorium te genereren geleid tot een vlaag van onderzoeksactiviteiten die heeft geleid tot nieuwe toepassingen en nieuwe technologieën. Een prominente toepassing betreft het gebruik van rHDL-deeltjes als een miniatuurmembraan om transmembraaneiwitten te huisvesten in een native-achtige omgeving5. Tot op heden zijn honderden eiwitten met succes opgenomen in discoïdale rHDL, en onderzoek heeft aangetoond dat deze eiwitten zowel inheemse conformatie als biologische activiteit behouden als receptoren, enzymen, transporters, enz. Van deze deeltjes, aangeduid als "nanodiscs", is ook aangetoond dat ze vatbaar zijn voor structurele karakterisering, vaak met een hoge resolutie6. Deze benadering van onderzoek naar transmembraaneiwitten wordt erkend als superieur aan studies met detergentenmicellen of liposomen en vordert als gevolg daarvan snel. Het is belangrijk om te erkennen dat er twee verschillende methoden zijn gemeld die in staat zijn om een rHDL te vormen. De "cholaatdialyse" methode13 is populair voor toepassingen die verband houden met de opname van transmembraaneiwitten in de rHDL bilayer5. In wezen omvat deze formuleringsmethode het mengen van een tweelaagse fosfolipide, een steigereiwit en het transmembraaneiwit van belang in een buffer die het detergent natriumcholaat (of natriumdeoxycholaat; micelmolecuulgewicht [MW] van 4.200 Da) bevat. Het reinigingsmiddel lost de verschillende reactiecomponenten effectief op, waardoor het monster kan worden gedialyseerd tegen buffergebrek aan reinigingsmiddel. Tijdens de dialysestap, als het wasmiddel uit het monster wordt verwijderd, vormt zich spontaan een rHDL. Wanneer deze benadering wordt gebruikt om een transmembraaneiwit van belang in de val te lokken, worden de productdeeltjes nanodiscs5 genoemd. Pogingen om deze methode te gebruiken om hydrofobe bioactieve stoffen met kleine moleculen (MW <1.000 Da) op te nemen, zijn echter grotendeels mislukt. In tegenstelling tot transmembraaneiwitten kunnen bioactieve stoffen met kleine moleculen samen met het wasmiddel uit de dialysezak ontsnappen, waardoor hun opname-efficiëntie in rHDLs sterk afneemt. Dit probleem werd opgelost door detergentia weg te laten uit het formuleringsmengsel14. In plaats daarvan worden de componenten achtereenvolgens aan een waterige buffer toegevoegd, te beginnen met de tweelaagse die lipide vormt, waardoor een stabiel bioactief middel wordt gevormd dat rHDL bevat, een nanoschijf genoemd. Anderen hebben rHDL gebruikt voor de opname en het transport van in vivo beeldvormende middelen7. Meer recent zijn gespecialiseerde rHDL, bestaande uit een apolipoproteïnesteiger en de anionische glycerofosfolipide, cardiolipine, gebruikt in ligandbindingsstudies. Deze deeltjes bieden een platform voor studies naar de interactie van cardiolipine met verschillende in water oplosbare liganden, waaronder calcium, cytochroom c en het antikankermiddel doxorubicine8.
De focus van deze studie ligt op de formulering van rHDL die een stabiel opgenomen hydrofoob bioactief middel (d.w.z. nanoschijf) bezitten. Het vermogen van deze middelen om te integreren in het lipidemilieu van discoïdale rHDL-deeltjes verleent ze effectief waterige oplosbaarheid. Als zodanig hebben nanoschijven het potentieel voor in vivo therapeutische toepassingen. Bij het formuleren van nanoschijven zijn specifieke incubatie- / reactieomstandigheden vereist om met succes discrete hydrofobe bioactieve stoffen in het productdeeltje op te nemen, en het doel van dit rapport is om gedetailleerde praktische informatie te bieden die kan worden gebruikt als een fundamentele sjabloon voor het maken van nieuwe nanoschijfdeeltjes voor specifieke toepassingen. In de context van dit manuscript zijn de termen nanodisc en nanodisk dus niet uitwisselbaar. Terwijl nanodisc verwijst naar een rHDL geformuleerd om een transmembraaneiwit te bevatten dat is ingebed in zijn lipide bilayer5, verwijst de term nanodisk naar een rHDL geformuleerd om hydrofobe bioactieve stoffen met een laag molecuulgewicht (< 1.000 Da) op te nemen, zoals amfotericine B14.
Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de verwerving van geschikte steigereiwitten. Het is mogelijk om steigereiwitten te kopen van fabrikanten [bijv. apoA-I (SRP4693) of apoE4 (A3234)], maar de kosten kunnen een beperkende factor zijn. Een voorkeursbenadering is om recombinante steigereiwitten tot expressie te brengen in Escherichia coli. Protocollen zijn gepubliceerd voor humaan apoA-I9, apoE410, evenals het insect hemolymfe-eiwit apolipophorin-III11. Voor de hierin beschreven experimenten werd gebruik gemaakt van recombinant humaan apoE4 N-terminale (NT) domein (aminozuren 1-183). De nucleotidesequentie die codeert voor menselijk apoE4-NT werd gesynthetiseerd en ingevoegd in een pET-22b (+) expressievector direct grenzend aan de vectorgecodeerde pelB-leidersequentie. Dit construct leidt tot de expressie van een pelB leader sequence-apoE4-NT fusie-eiwit. Na eiwitsynthese leidt de bacteriële pelB-leidersequentie het nieuw gesynthetiseerde eiwit naar de periplasmatische ruimte waar leider peptidase de pelB-sequentie splitst. Het resulterende apoE4-NT-eiwit, zonder sequentietags of staarten, ontsnapt vervolgens aan de bacteriën en hoopt zich op in het kweekmedium11,12, waardoor de verwerking stroomafwaarts wordt vereenvoudigd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

De term nanoschijf verwijst naar een discreet type nanodeeltje dat bestaat uit een tweelaags lipide, een steigereiwit en een geïntegreerd bioactief middel. Nanoschijven zijn georganiseerd als een schijfvormige lipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door het steigereiwit, meestal een lid van de uitwisselbare apolipoproteïnefamilie. Talrijke hydrofobe bioactieve stoffen zijn efficiënt opgelost in nanoschijven door hun integratie in het hydrofobe milieu van de lipide bilayer van het deeltje, wat een grotendeels homogene populatie deeltjes oplevert in het bereik van 10-20 nm in diameter. De formulering van nanoschijven vereist een nauwkeurige verhouding van individuele componenten, een geschikte sequentiële toevoeging van elke component, gevolgd door badsonificatie van het formuleringsmengsel. Het amfipathische scaffold-eiwit maakt spontaan contact met en reorganiseert het gedispergeerde dubbellaagse mengsel van lipide / bioactieve stof om een discrete, homogene populatie van nanoschijfdeeltjes te vormen. Tijdens dit proces gaat het reactiemengsel over van een ondoorzichtig, troebel uiterlijk naar een geklaard monster dat, wanneer het volledig is geoptimaliseerd, geen neerslag oplevert bij centrifugeren. Karakteriseringsstudies omvatten de bepaling van de oplosefficiëntie van bioactieve stoffen, elektronenmicroscopie, gelfiltratiechromatografie, ultraviolet zichtbare (UV / Vis) absorptiespectroscopie en / of fluorescentiespectroscopie. Dit wordt normaal gesproken gevolgd door een onderzoek naar biologische activiteit met behulp van gekweekte cellen of muizen. In het geval van nanoschijven die een antibioticum bevatten (d.w.z. het macrolide polyeenantibioticum amfotericine B), kan hun vermogen om de groei van gist of schimmels te remmen als functie van concentratie of tijd worden gemeten. Het relatieve gemak van formulering, veelzijdigheid met betrekking tot componenten, deeltjesgrootte op nanoschaal, inherente stabiliteit en waterige oplosbaarheid maakt talloze in vitro en in vivo toepassingen van nanoschijftechnologie mogelijk. In dit artikel beschrijven we een algemene methodologie om nanoschijven die amfotericine B bevatten te formuleren en te karakteriseren als het hydrofobe bioactieve middel.

Bioactief middel nanoschijf formuleringsproces In de beschreven ampB-nanoschijfformuleringsprocedure wordt de reactie als voltooid beschouwd wanneer het uiterlijk van het monster overgaat van troebel naar helder (figuur 1). Deze verandering geeft aan dat nanoschijven zijn gevormd en dat het bioactieve middel is opgelost. Vaak absorberen bioactieve stoffen licht in het zichtbare golflengtegebied (bijv. AmpB, curcumine, luteïne, co-enzym Q10) en in deze gevallen...

Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Hier beschrijven we de productie en karakterisering van bioactieve stoffen die nanoschijven bevatten. Amfotericine B nanoschijven worden als voorbeeld genomen om het protocol stapsgewijs te beschrijven.

Formulering en karakterisering van bioactieve stof die nanoschijven bevat

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Dit protocol biedt praktische kennis, nuttig voor het formuleren van nanoschaaldeeltjes, d.w.z. nanoschijven, die stabiel een breed scala aan hydrofobe bioactieve moleculen bevatten. Deze methode kent vele praktische toepassingen.Het vermogen om waterige oplosbaarheid te verlenen aan anders onoplosbare bioactieve verbindingen maakt het gebruik van nanoschijven in toepassingen voor medicijnafgifte mogelijk. De beschreven methode is eenvoudig. Het heeft de voorkeur om studies uit te voeren op de beschreven schaal, vijf milligram fosfolipide, twee milligram steigereiwit, zodat de vorming van nanoschijven gemakkelijk kan worden gecontroleerd door visuele inspectie.Michael Karo en Matthew Swackhammer, niet-gegradueerde studentonderzoekers in het Ryan-lab, zullen de procedure demonstreren. Om een fosfolipide aliquot te bereiden, weegt u vijf milligram DMPC en brengt u het over in een glazen reageerbuis. Los het fosfolipide op door 300 microliter chloroform en 100 microliter methanol toe te voegen voor een verhouding van drie op één.Verdamp het organische oplosmiddel door de glazen reageerbuis gedurende 10 tot 15 minuten onder een zachte stroom stikstofgas te plaatsen, zodat zich een dunne film van gedroogd fosfolipide vormt langs de wanden van het onderste deel van de buis. Om amfotericine B- of AmpB-nanoschijven te formuleren, pipetteer 450 microliter PBS naar de gelyofiliseerde fosfolipide-aliquot en vortex gedurende 30 seconden om het lipide te verspreiden. Pipetteer 50 microliter van 20 milligram per milliliter voorraad AmpB-oplossing in het gedispergeerde fosfolipidemonster en vortex.Voeg 500 microliter van vier milligram per milliliter ApoE4 NT steigereiwit toe aan de glazen reageerbuis met het gedispergeerde fosfolipide en AmpB. Soniceer het monster bij 24 graden Celsius totdat de oplossing helder wordt. Voor AmpB-Nanodisk dialyse, bereid een deel van de dialyseslang voor door het grondig te weken in gedestilleerd gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.Klem met behulp van een dialyslangklem het ene uiteinde van de geweekte dialyseslang vast, zodat er geen vloeistof kan ontsnappen. Steek een smalle nektrechter in het open uiteinde van de dialysebuis en breng het AmpB-Nanodisk-monster over in de dialysebuis. Verwijder de trechter en klem het uiteinde van de dialyseslang vast met een andere dialysebuisklem.Plaats een schuimdialyse-drijf op een van de afgesloten uiteinden van de dialyseslang en plaats de geassembleerde dialyseslang in het bekerglas met vers bereide PBS-buffer van één liter. Plaats een magnetische roerstaaf in de bodem van het bekerglas en stel de roerregeling laag in, zodat er geen draaikolk ontstaat. Laat de dialyse 's nachts doorgaan bij vier graden Celsius.Schakel de spectrofotometer in door de aan/uit-schakelaar om te draaien en maak verbinding met een overeenkomstige ondersteuningscomputer door op pc-besturing te drukken. Open op de ondersteuningscomputer de software met het label UVProbe 2.61 en maak verbinding met de spectrofotometer door in de linkerbenedenhoek op verbinden te klikken. Klik op het spectrum en klik vervolgens op methode"in de bovenste werkbalk.Klik op het tabblad Meting en voer 500 in het tekstvak "begin" in dat zich onder het golflengtebereik bevindt en 300 in het tekstvak aan het einde. Klik op het vervolgkeuzemenu naast het tabblad met het label scansnelheid en stel het in op gemiddeld. Bereid een monster blanco voor door één milliliter DMSO over te brengen in twee kwartscuvetten.Laad beide cuvetten in de respectievelijke monsterpoorten van de spectrofotometer. Klik op automatisch leeg en neem een spectrum op van 300 tot 500 nanometer door op start te klikken in de linkerbenedenhoek. Voor ampB-standaard spectrale analyse verwijdert u de cuvette uit de voorste monsterpoort en voegt u 20 microliter van één milligram per milliliter AmpB-stamoplossing toe.Laad de cuvette terug in het monsterbord en klik op start" om de absorptie van het monster te registreren. Verwijder na het opnemen van de absorptie van het monster de cuvette en decanteer de vloeibare inhoud in een afvalcontainer. Spoel de cuvette grondig af met drie wasbeurten van gedeïoniseerd water, gevolgd door drie wasbeurten met 70% ethanol.Voor spectrale analyse van verstoorde AmpB-Nanodisk, bereidt u het monster voor door 20 microliter van één milligram per milliliter AmpB-Nanodisk-voorraad in één milliliter DMSO te pipetteren en gedurende één minuut te incuberen voordat het spectrum wordt opgenomen. Plaats de cuvette in de voorste monsterpoort en klik op start" om de absorptie van het monster vast te leggen. Voor spectrale analyse van een PBS-buffer blanco, bereidt u een blanco voor door één milliliter PBS over te brengen in twee kwartscuvetten.Laad de cuvetten in de monsterpoort. Klik op automatisch leeg en neem het spectrum op van 300 tot 500 nanometer. Voor spectrale analyse van een niet-verstoord AmpB-Nanodisk-monster verwijdert u de cuvette uit de voorste monsterpoort en voegt u 20 microliter van een ampB-nanoschijfmonster van één milligram per milliliter toe aan de PBS-buffer.Laad de cuvette terug in het monsterbord. Klik op start" en neem het voorbeeldspectrum op. De AmpB-Nanodisk formuleringsreactie wordt als voltooid beschouwd wanneer het uiterlijk van het monster overgaat van troebel naar helder.UV-zichtbare absorptiespectroscopie van AmpB-monsters in DMSO en PBS wordt getoond. In DMSO werden drie onderscheidende absorptiemaxima waargenomen op 372, 392 en 415 nanometer, pieken die wijzen op AmpB. De absorptiespectra van AmpB-Nanoschijven in PBS vertoonden een enkele grote absorptiepiek bij een kortere golflengte.Ter vergelijking: de absorptiespectra van AmpB-Nanoschijven in DMSO leken vergelijkbaar met de spectra van voorraad AmpB. Biologische activiteit van AmpB-Nanodisks werd uitgevoerd door het beoordelen van gistgroeiremmingstests. Controlemonsters zoals PBS, DMSO en gereconstitueerde lipoproteïnen met hoge dichtheid toonden aan dat andere nanoschijfcomponenten dan AmpB geen waarneembaar effect hebben op de gistgroei.De positieve controle bevestigde dat AmpB een efficiënte remmer van gistgroei is. In het geval van AmpB-Nanodisks werd concentratieafhankelijke groeiremmingsactiviteit waargenomen. Niet alle nanoschijfpreparaten zijn hetzelfde.Sommige kunnen meer tijd, andere lipiden of andere steigereiwitten nodig hebben. Ze zijn alleen onduidelijk} is de verduidelijking van het nanoschijfmonster. Deze techniek heeft geleid tot nieuwe nanodeeltjes die worden gebruikt om doxorubicine-geïnduceerde cardiotoxiciteit, apoptose, ligandinteracties te bestuderen en leverde tal van waterige onoplosbare bioactieve moleculen, waaronder luteïne en curcumine.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functionele karakterisering van Carboxylesterases in Insecticide resistente huis vliegt, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...