Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (R37 HL-64159).

1. טרנספורמציה, ביטוי וטיהור של רכיב חלבון פיגום
<ol><li>טרנספורמציה חיידקית BL21 עם apoE4-NT המכיל פלסמיד<ol><li>הפשירו צינור של תאים מוכשרים BL21 (DE3) על קרח למשך 10 דקות.</li>
		<li>לאחר שכל הקרח נמס, ערבבו בעדינות ובזהירות פיפטה 50 μL של התאים לתוך צינור טרנספורמציה על קרח.</li>
		<li>הוסף 5 μL המכיל 50 ng של D...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

ניסוח של חומר ביו-אקטיבי המכיל ננו-דיסקים מספק שיטה נוחה להמיס תרכובות הידרופוביות בלתי מסיסות אחרת. מאחר שהננו-דיסקים של הסוכן הביו-אקטיבי של המוצר מסיסים לחלוטין במדיה מימית, הם מספקים שיטת העברה שימושית למגוון רחב של מולקולות הידרופוביות (טבלה 1). אלה כוללים מולקולות קטנות, תרו...

ליפופרוטאינים דיסקואידים בצפיפות גבוהה (HDLs) הם אבות טבעיים של HDL כדורי הרבה יותר נפוץ הקיים במערכת הדם האנושית. חלקיקים חדשים אלה, המכונים גם pre-ß HDL, הם בעלי תכונות מבניות ייחודיות וייחודיות1. ואכן, במקום להתקיים כחלקיק כדורי, HDL מתהווה הוא בצורת דיסק. מחקרי אפיון מבניים נרחבים על HDL דיסקואידים טבעיים ומשוחזרים גילו כי הם מורכבים מדו-שכבה פוספוליפידית שהיקפה מוקפת על ידי אפוליפופרוטאין אמפיפתי הניתן להחלפה (apo), כגון apoA-I. במטבוליזם של ליפופרוטאינים אנושיים, HDLs מתהווים במחזור צוברים שומנים מתאים היקפיים ומבשילים ל-HDL כדוריים בתהליך התלוי במתווכי חלבונים מרכזיים, כולל מעביר קלטות קושר ATP A1 ולציטין:כולסטרול אצילטרנספראז2. תהליך זה מהווה מרכיב קריטי במסלול העברת כולסטרול הפוך שנחשב כמגן מפני מחלות לב. חמושים בידע זה וביכולת לשחזר HDL דיסקואידלי, חוקרים השתמשו בחלקיקים אלה כהתערבות טיפולית לטיפול בטרשת עורקים3. בעיקרו של דבר, עירוי של HDL משוחזר (rHDL) לחולים מקדם את שטף הכולסטרול ממשקעי פלאק ומחזיר אותו לכבד לצורך המרה לחומצות מרה והפרשת מהגוף. מספר חברות ביוטכנולוגיה / תרופות נוקטות באסטרטגיית טיפול זו4.
במקביל, היכולת לייצר חלקיקים אלה במעבדה עוררה גל של פעילויות מחקר שהובילו ליישומים חדשים וטכנולוגיות חדשות. יישום בולט אחד כולל שימוש בחלקיקי rHDL כקרום מיניאטורי כדי לאכלס חלבונים טרנסממברנליים בסביבה דמוית ילידים5. עד כה, מאות חלבונים שולבו בהצלחה ב-rHDL דיסקואידלי, ומחקרים הוכיחו כי חלבונים אלה שומרים הן על קונפורמציה טבעית והן על פעילות ביולוגית כקולטנים, אנזימים, טרנספורטרים וכו'. חלקיקים אלה, המכונים "ננודיסקים", הוכחו גם כמתאימים לאפיון מבני, לעתים קרובות ברזולוציה גבוהה6. גישה זו לחקירות של חלבונים טרנסממברנליים מוכרת כעדיפה על מחקרים עם מיצלות דטרגנטים או ליפוזומים, וכתוצאה מכך, היא מתקדמת במהירות. חשוב להכיר בכך שדווחו שתי שיטות שונות המסוגלות ליצור rHDL. שיטת "דיאליזה כולאט"13 פופולרית ליישומים הקשורים לשילוב חלבונים טרנסממברנליים בשכבה הדו-שכבתיתrHDL 5. בעיקרו של דבר, שיטת ניסוח זו כוללת ערבוב של פוספוליפיד דו-שכבתי היוצר פוספוליפיד, חלבון פיגום והחלבון הטרנסממברנה המעניין במאגר המכיל את חומר הניקוי נתרן כולאט (או נתרן דאוקסיכולאט; משקל מולקולרי של מיצלה [MW] של 4,200 Da). חומר הניקוי מסיס ביעילות את מרכיבי התגובה השונים, ומאפשר לדגימה להיות מחוייגת כנגד חיץ חסר חומר ניקוי. במהלך שלב הדיאליזה, כאשר חומר הניקוי מוסר מהדגימה, נוצר rHDL באופן ספונטני. כאשר משתמשים בגישה זו כדי ללכוד חלבון טרנסממברנה מעניין, חלקיקי המוצר כונו ננודיסקים5. ניסיונות להשתמש בשיטה זו כדי לשלב חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים של מולקולות קטנות (MW <1,000 Da), עם זאת, לא צלחו ברובם. שלא כמו חלבונים טרנסממברנליים, חומרים ביו-אקטיביים של מולקולות קטנות מסוגלים לברוח משקית הדיאליזה יחד עם חומר הניקוי, מה שמקטין מאוד את יעילות השילוב שלהם ב-rHDLs. בעיה זו נפתרה על ידי השמטת חומרי ניקוי מתערובת הפורמולציה14. במקום זאת, הרכיבים מתווספים למאגר מימי ברצף, החל מהשכבה הדו-שכבתית היוצרת שומנים, ויוצרים סוכן ביו-אקטיבי יציב המכיל rHDL, המכונה ננודיסק. אחרים השתמשו ב-rHDL לשילוב והובלה של חומרי הדמיה in vivo 7. לאחרונה, rHDL מיוחד המורכב מפיגום אפוליפופרוטאין והגליצרופוספוליפיד האניוני, קרדיוליפין, שימשו במחקרי קשירת ליגנדים. חלקיקים אלה מספקים פלטפורמה למחקרים על האינטראקציה של cardiolipin עם ליגנדות מסיסים במים שונים, כולל סידן, cytochrome c, ואת סוכן אנטי סרטני doxorubicin8.
המחקר הנוכחי מתמקד בניסוח rHDL בעל חומר ביו-אקטיבי הידרופובי משולב יציב (כלומר ננודיסק). היכולת של חומרים אלה להשתלב בסביבה השומנית של חלקיקי rHDL דיסקואידים מעניקה להם ביעילות מסיסות מימית. ככאלה, לננודיסקים יש פוטנציאל ליישומים טיפוליים in vivo . בעת גיבוש ננו-דיסקים, נדרשים תנאי דגירה/תגובה ספציפיים כדי לשלב בהצלחה חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים בדידים בחלקיק המוצר, ומטרת דוח זה היא לספק מידע מעשי מפורט שיכול לשמש כתבנית בסיסית ליצירת חלקיקי ננו-דיסק חדשניים עבור יישומים ספציפיים. לפיכך, בהקשר של כתב יד זה המונחים ננודיסק וננודיסק אינם ניתנים להחלפה. בעוד שננודיסק מתייחס ל-rHDL שנוסח להכיל חלבון טרנסממברנה המוטבעבשכבה הדו-שכבתית 5 של השומנים, המונח ננו-דיסק מתייחס ל-rHDL שנוסח לשלב משקל מולקולרי נמוך (< 1,000 Da) חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים, כגון אמפוטריצין B14.
קיימות מגוון שיטות לרכישת חלבוני פיגומים מתאימים. ניתן לרכוש חלבוני פיגומים מיצרנים [למשל apoA-I (SRP4693) או apoE4 (A3234)], אולם העלות עשויה להיות גורם מגביל. גישה מועדפת היא לבטא חלבוני פיגום רקומביננטיים ב- Escherichia coli. פרוטוקולים מתפרסמים עבור apoA-I9, apoE410 אנושי, כמו גם חלבון המולימפה אפוליפופורין-III11. לצורך הניסויים המתוארים כאן, נעשה שימוש בדומיין רקומביננטי אנושי מסוג apoE4 N-terminal (NT) (חומצות אמינו 1-183). רצף הנוקלאוטידים המקודד apoE4-NT האנושי סונתז והוכנס לווקטור ביטוי pET-22b (+) הסמוך ישירות לרצף מובילי pelB המקודד על ידי וקטור. מבנה זה מוביל לביטוי של חלבון היתוך מוביל pelB - apoE4-NT. לאחר סינתזת חלבונים, רצף מובילי pelB חיידקי מכוון את החלבון החדש המסונתז לחלל הפריפלסמי שבו פפטידאז מוביל חותך את רצף pelB. חלבון apoE4-NT המתקבל, ללא תגי רצף או זנבות, בורח לאחר מכן מהחיידקים ומצטבר בתווך התרבית11,12, מה שמפשט את העיבוד במורד הזרם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

המונח ננו-דיסק מתייחס לסוג בדיד של ננו-חלקיק המורכב מליפיד דו-שכבתי היוצר שומנים, חלבון פיגום וסוכן ביו-אקטיבי משולב. ננו-דיסקים מאורגנים כדו-שכבה ליפידית בצורת דיסק שהיקפו מוקף על ידי חלבון הפיגומים, בדרך כלל חבר במשפחת אפוליפופרוטאין הניתן להחלפה. חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים רבים נמסו ביעילות בננו-דיסקים על ידי שילובם בסביבה ההידרופובית של דו-שכבת השומנים של החלקיק, והניבו אוכלוסייה הומוגנית ברובה של חלקיקים בקוטר של 10-20 ננומטר. הניסוח של ננודיסקים דורש יחס מדויק של רכיבים בודדים, תוספת רציפה מתאימה של כל רכיב, ואחריו סוניקציה של תערובת הפורמולציה. חלבון הפיגום האמפיפתי בא במגע ספונטני ומארגן מחדש את תערובת השומנים/חומרים ביו-אקטיביים המפוזרים ויוצר אותם ליצירת אוכלוסייה בדידה והומוגנית של חלקיקי ננו-דיסק. במהלך תהליך זה, תערובת התגובה עוברת ממראה אטום ועכור לדגימה מזוקקת, שכאשר היא ממוטבת במלואה, אינה מניבה משקעים בצנטריפוגה. מחקרי אפיון כוללים קביעת יעילות מסיסות של חומרים ביו-אקטיביים, מיקרוסקופ אלקטרונים, כרומטוגרפיית סינון ג'ל, ספקטרוסקופיית ספיגה אולטרה סגולה גלויה (UV/Vis) ו/או ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית. זה בדרך כלל ואחריו חקירה של פעילות ביולוגית באמצעות תאים בתרבית או עכברים. במקרה של ננודיסקים המכילים אנטיביוטיקה (כלומר, אנטיביוטיקה פוליאן מקרוליד אמפוטריצין B), ניתן למדוד את יכולתם לעכב צמיחה של שמרים או פטריות כפונקציה של ריכוז או זמן. קלות הניסוח היחסית, הרבגוניות ביחס לחלקי הרכיבים, גודל החלקיקים הננומטריים, היציבות הטבועה והמסיסות המימית מאפשרים יישומים רבים במבחנה ו-in vivo של טכנולוגיית ננו-דיסק . במאמר זה, אנו מתארים מתודולוגיה כללית לניסוח ואפיון ננודיסקים המכילים אמפוטריצין B כסוכן ביו-אקטיבי הידרופובי.

תהליך ניסוח ננודיסק סוכן ביו-אקטיבי בהליך ניסוח ampB-nanodisk המתואר, התגובה נחשבת לשלמה כאשר מראה הדגימה משתנה מעכירות לצלולה (איור 1). שינוי זה מצביע על כך שננו-דיסקים נוצרו וכי הסוכן הביו-אקטיבי היה מסיס. לעתים קרובות, חומרים ביו-אקטיביים בולעים אור באזור אורך הגל הנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

כאן אנו מתארים ייצור ואפיון של חומרים ביו-אקטיביים המכילים ננו-דיסקים. ננודיסקים של Amphotericin B נלקחים כדוגמה לתיאור הפרוטוקול בצורה מדורגת.

ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

פרוטוקול זה מספק ידע מעשי, שימושי לניסוח חלקיקים ננומטריים, כלומר ננו-דיסקים, המשלבים ביציבות מגוון רחב של מולקולות ביו-אקטיביות הידרופוביות. לשיטה זו יישומים מעשיים רבים.היכולת להעניק מסיסות מימית לתרכובות ביו-אקטיביות בלתי מסיסות אחרת מאפשרת שימוש בננו-דיסקים ביישומי העברת תרופות. השיטה המתוארת היא פשוטה. עדיף לערוך מחקרים בקנה מידה המתואר, חמישה מיליגרם פוספוליפיד, שני מיליגרם חלבון פיגום, כך היווצרות של ננודיסקים מנוטר בקלות על ידי בדיקה חזותית.מי שידגימו את ההליך יהיו מייקל קארו ומתיו סוואקהמר, סטודנטים לתואר ראשון חוקרים במעבדת ריאן. כדי להכין aliquot פוספוליפיד, לשקול חמישה מיליגרם של DMPC ולהעביר אותו למבחנה זכוכית. להמיס את הפוספוליפידים על ידי הוספת 300 מיקרוליטר כלורופורם ו -100 מיקרוליטר מתנול ביחס של שלושה לאחד.אידוי הממס האורגני על ידי הנחת מבחנה זכוכית תחת זרם עדין של גז חנקן למשך 10 עד 15 דקות, כך שנוצר סרט דק של פוספוליפידים מיובשים לאורך דפנות החלק התחתון של הצינור. כדי לנסח אמפוטריצין B או AmpB-Nanodisks, פיפטה 450 מיקרוליטר של PBS לאליקוט פוספוליפידים lyophilized, ומערבולת במשך 30 שניות כדי לפזר את השומנים. פיפטה 50 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר מלאי תמיסת AmpB לתוך דגימת פוספוליפידים מפוזרים ומערבולת.הוסף 500 מיקרוליטר של ארבעה מיליגרם למיליליטר חלבון פיגום ApoE4 NT למבחנה זכוכית המכילה את הפוספוליפידים המפוזרים ואת AmpB. יש להסוות את הדגימה בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס עד להתבהרות התמיסה. לדיאליזה AmpB-Nanodisk, הכינו קטע של צינורות דיאליזה על ידי השרייתו ביסודיות במים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה למשך 10 דקות.באמצעות מהדק צינורות דיאליזה, הדקו קצה אחד של צינור הדיאליזה הספוג, כדי להבטיח שאף נוזל לא יוכל לברוח. הכנס משפך צוואר צר לקצה הפתוח של צינור הדיאליזה והעבר את דגימת AmpB-Nanodisk לצינורות הדיאליזה. הסר את המשפך, ומהדק את קצה צינור הדיאליזה עם מהדק צינור דיאליזה נוסף.הניחו צף דיאליזה מוקצף על אחד הקצוות האטומים של צינור הדיאליזה, והכניסו את צינור הדיאליזה המורכב לתוך הכד המכיל חיץ PBS טרי של ליטר אחד. הניחו מוט ערבוב מגנטי בתחתית הכד וכווננו את בקרת הערבוב לנמוכה, כדי להבטיח שלא תיווצר מערבולת. אפשר להמשיך את הדיאליזה במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.הפעל את הספקטרופוטומטר על-ידי היפוך מתג ההפעלה והתחבר למחשב תמיכה מתאים על-ידי הקשה על PC Control. במחשב התמיכה, פתח את התוכנה שכותרתה UVProbe 2.61, והתחבר לספקטרופוטומטר על ידי לחיצה על התחבר"בפינה השמאלית התחתונה. לחץ על הספקטרום ולאחר מכן לחץ על שיטה"בסרגל הכלים העליון.לחץ על כרטיסיית המדידה והזן 500 לתיבת הטקסט התחלה הממוקמת בטווח אורכי הגל, ו- 300 לתיבת הטקסט "הסופית". לחץ על התפריט הנפתח לצד הכרטיסייה שכותרתה מהירות סריקה"והגדר אותה לבינונית. הכינו דגימה ריקה על ידי העברת מיליליטר אחד של DMSO לשתי קוביות קוורץ.טען את שתי הקוביות לתוך יציאות הדגימה המתאימות של הספקטרופוטומטר. לחץ על ריק אוטומטי"והקלט ספקטרום מ 300 עד 500 ננומטר על ידי לחיצה על התחל"בפינה השמאלית התחתונה. לניתוח ספקטרלי סטנדרטי של AmpB, הסר את הקובט מיציאת הדגימה הקדמית והוסף 20 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת מלאי AmpB.טען את הקובט בחזרה ללוח הדגימה ולחץ על "התחל" כדי להקליט את ספיגת הדגימה. לאחר רישום ספיגת הדגימה, מוציאים את הקובט ומרוקנים את תכולת הנוזל למיכל פסולת. שטפו היטב את הקובטה עם שלוש שטיפות של מים נטולי יונים, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם 70% אתנול.לניתוח ספקטרלי של AmpB-Nanodisk משובש, הכינו את הדגימה על ידי פיפטציה של 20 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר מלאי AmpB-Nanodisk למיליליטר אחד של DMSO, ודגרו במשך דקה אחת לפני הקלטת הספקטרום. טען את הקובט ליציאת הדגימה הקדמית ולחץ על "התחל" כדי להקליט את ספיגת הדגימה. לניתוח ספקטרלי של חיץ PBS ריק, הכינו ריק על ידי העברת מיליליטר אחד של PBS לשתי קוביות קוורץ.טען את הקוביטות ליציאת הדגימה. לחץ על אוטומטי ריק" והקלט את הספקטרום מ 300 עד 500 ננומטר. לניתוח ספקטרלי של דגימת AmpB-Nanodisk ללא הפרעה, הסר את הקובט מיציאת הדגימה הקדמית והוסף 20 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר דגימת AmpB-Nanodisk למאגר PBS.טען את הקובט בחזרה ללוח הדגימה. לחץ על התחל" והקלט את ספקטרום הדגימות. תגובת ניסוח AmpB-Nanodisk נחשבת לשלמה כאשר מראה הדגימה משתנה מעכיר לברור.ספקטרוסקופיית בליעה נראית UV של דגימות AmpB ב- DMSO ו- PBS מוצגת. ב-DMSO נצפו שלושה מקסימום ספיגה ייחודי ב-372, 392 ו-415 ננומטר, פסגות המעידות על AmpB. ספקטרום הבליעה של AmpB-Nanodisks ב-PBS הראה שיא בליעה עיקרי יחיד באורך גל קצר יותר.לשם השוואה, ספקטרום הספיגה של AmpB-Nanodisks ב-DMSO נראה דומה לספקטרום של מלאי AmpB. הפעילות הביולוגית של AmpB-Nanodisks בוצעה על ידי הערכת מבחני עיכוב צמיחת שמרים. דגימות בקרה כמו PBS, DMSO וליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה שהוכיחו כי לרכיבי ננו-דיסקים שאינם AmpB אין השפעה ניכרת על גדילת שמרים.הבקרה החיובית אישרה כי AmpB הוא מעכב יעיל של צמיחת שמרים. במקרה של AmpB-Nanodisks, נצפתה פעילות עיכוב גדילה תלוית ריכוז. לא כל תכשירי הננו-דיסק זהים.חלקם עשויים לדרוש זמן רב יותר, שומנים שונים, או חלבוני פיגומים שונים. הם רק לא ברורים} הוא הבהרה של דגימת ננודיסק. טכניקה זו הובילה לננו-חלקיקים חדשניים המשמשים לחקר רעילות לב הנגרמת על ידי דוקסורוביצין, אפופטוזיס, אינטראקציות ליגנד, וסיפקה מולקולות ביו-אקטיביות מימיות בלתי מסיסות רבות, כולל לוטאין וכורכומין.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

אפיון פונקציונלי Carboxylesterases הבית בקוטלי חרקים עמידים בזבובים, דומסטיקה זבוב

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...