Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (R37 HL-64159).

1. Trasformazione, espressione e purificazione della componente proteica dello scaffold
<ol><li>Trasformazione batterica BL21 con plasmide contenente apoE4-NT<ol><li>Scongelare un tubo di cellule competenti BL21 (DE3) sul ghiaccio per 10 minuti.</li>
		<li>Una volta che tutto il ghiaccio si è sciolto, mescolare delicatamente e accuratamente pipettare 50 μL delle cellule in un tubo di trasformazione su ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 5 μL contenenti 50 ng di DNA plasmidico (per la sequenza, vedere <s...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

La formulazione di un agente bioattivo contenente nanodischi fornisce un metodo conveniente per solubilizzare composti idrofobici altrimenti insolubili. Poiché i nanodischi dell'agente bioattivo prodotto sono completamente solubili in mezzi acquosi, forniscono un utile metodo di rilascio per un'ampia gamma di molecole idrofobiche (Tabella 1). Questi includono piccole molecole, droghe naturali e sintetiche, fitonutrienti, ormoni, ecc. La strategia di formulazione segue solitamente un protocollo standard ...

Le lipoproteine discoidali nascenti ad alta densità (HDL) sono progenitori naturali delle HDL sferiche molto più abbondanti presenti nel sistema circolatorio umano. Queste particelle nascenti, note anche come pre-ß HDL, possiedono proprietà strutturali uniche e distintive1. Infatti, piuttosto che esistere come particella sferoidale, le HDL nascenti sono a forma di disco. Studi approfonditi di caratterizzazione strutturale su HDL discoidali naturali e ricostituite hanno rivelato che sono costituiti da un doppio strato fosfolipidico il cui perimetro è circoscritto da un'apolipoproteina anfipatica scambiabile (apo), come l'apoA-I. Nel metabolismo delle lipoproteine umane, le HDL nascenti circolanti accumulano lipidi dalle cellule periferiche e maturano in HDL sferiche in un processo che dipende da mediatori proteici chiave, tra cui il trasportatore di cassette leganti ATP A1 e lecitina: colesterolo aciltransfere2. Questo processo rappresenta una componente critica della via di trasporto inversa del colesterolo che è considerata protettiva contro le malattie cardiache. Armati di questa conoscenza e della capacità di ricostituire HDL discoidali, i ricercatori hanno impiegato queste particelle come intervento terapeutico per trattare l'aterosclerosi3. In sostanza, l'infusione di HDL ricostituito (rHDL) nei pazienti promuove l'efflusso di colesterolo dai depositi di placca e lo restituisce al fegato per la conversione in acidi biliari e l'escrezione dal corpo. Diverse aziende biotecnologiche/farmaceutiche stanno perseguendo questa strategia di trattamento4.
Allo stesso tempo, la capacità di generare queste particelle in laboratorio ha scatenato una raffica di attività di ricerca che hanno portato a nuove applicazioni e nuove tecnologie. Un'applicazione importante riguarda l'uso di particelle rHDL come membrana in miniatura per ospitare proteine transmembrana in un ambiente nativo5. Ad oggi, centinaia di proteine sono state incorporate con successo nella rHDL discoidale e la ricerca ha dimostrato che queste proteine mantengono sia la conformazione nativa che l'attività biologica come recettori, enzimi, trasportatori, ecc. Queste particelle, denominate "nanodischi", hanno anche dimostrato di essere suscettibili di caratterizzazione strutturale, spesso ad alta risoluzione6. Questo approccio allo studio delle proteine transmembrana è riconosciuto come superiore agli studi con micelle detergenti o liposomi e, di conseguenza, sta rapidamente avanzando. È importante riconoscere che sono stati descritti due metodi distinti che sono in grado di formare un rHDL. Il metodo "dialisi colata"13 è popolare per applicazioni relative all'incorporazione di proteine transmembrana nelbistrato 5 rHDL. Essenzialmente, questo metodo di formulazione prevede la miscelazione di un fosfolipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e la proteina transmembrana di interesse in un tampone contenente il detergente colato di sodio (o desossicolato di sodio; peso molecolare della micella [MW] di 4.200 Da). Il detergente solubilizza efficacemente i diversi componenti della reazione, consentendo di dializzare il campione contro tampone privo di detergente. Durante la fase di dialisi, quando il detergente viene rimosso dal campione, si forma spontaneamente un rHDL. Quando questo approccio viene utilizzato per intrappolare una proteina transmembrana di interesse, le particelle prodotto sono state definite nanodischi5. I tentativi di utilizzare questo metodo per incorporare agenti bioattivi idrofobici a piccole molecole (MW <1.000 Da), tuttavia, sono stati in gran parte infruttuosi. A differenza delle proteine transmembrana, gli agenti bioattivi a piccole molecole sono in grado di fuoriuscire dalla sacca di dialisi insieme al detergente, diminuendo notevolmente la loro efficienza di incorporazione nelle rHDL. Questo problema è stato risolto omettendo i detergenti dalla miscela di formulazione14. Invece, i componenti vengono aggiunti a un tampone acquoso in sequenza, iniziando con il lipide che forma il doppio strato, formando un agente bioattivo stabile contenente rHDL, indicato come nanodisk. Altri hanno utilizzato rHDL per l'incorporazione e il trasporto di agenti di imaging in vivo 7. Più recentemente, rHDL specializzato composto da un'impalcatura di apolipoproteina e il glicerofosfolipide anionico, cardiolipina, sono stati impiegati in studi di legame del ligando. Queste particelle forniscono una piattaforma per studi sull'interazione della cardiolipina con vari ligandi solubili in acqua, tra cui calcio, citocromo c e l'agente antitumorale doxorubicina8.
Il focus del presente studio è sulla formulazione di rHDL che possiedono un agente bioattivo idrofobico stabilmente incorporato (cioè nanodisk). La capacità di questi agenti di integrarsi nell'ambiente lipidico delle particelle rHDL discoidali conferisce loro efficacemente la solubilità acquosa. In quanto tali, i nanodischi hanno il potenziale per applicazioni terapeutiche in vivo . Quando si formulano i nanodisk, sono necessarie specifiche condizioni di incubazione / reazione per incorporare con successo agenti bioattivi idrofobici discreti nella particella del prodotto e l'obiettivo di questo rapporto è fornire informazioni pratiche dettagliate che possono essere utilizzate come modello fondamentale per la creazione di nuove particelle di nanodisk per applicazioni specifiche. Pertanto, nel contesto di questo manoscritto i termini nanodisco e nanodisco non sono intercambiabili. Mentre nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per contenere una proteina transmembrana incorporata nel suo doppio strato lipidico5, il termine nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per incorporare agenti bioattivi idrofobici a basso peso molecolare (< 1.000 Da), come l'amfotericina B14.
Sono disponibili vari metodi per l'acquisizione di proteine di scaffold adatte. È possibile acquistare proteine di scaffold da produttori [ad esempio apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], tuttavia, il costo può essere un fattore limitante. Un approccio preferito è quello di esprimere le proteine dello scaffold ricombinante in Escherichia coli. I protocolli sono pubblicati per l'apoA-I9, l'apoE410 umano e la proteina emolinfatica degli insetti apolipophorin-III11. Ai fini degli esperimenti qui descritti, è stato utilizzato il dominio ricombinante umano apoE4 N-terminale (NT) (amminoacidi 1-183). La sequenza nucleotidica che codifica per l'apoE4-NT umano è stata sintetizzata e inserita in un vettore di espressione pET-22b (+) direttamente adiacente alla sequenza leader pelB codificata da vettori. Questo costrutto porta all'espressione di una proteina di fusione pelB leader sequence-apoE4-NT. Dopo la sintesi proteica, la sequenza leader pelB batterica dirige la proteina appena sintetizzata nello spazio periplasmatico dove la peptidasi leader fende la sequenza pelB. La proteina apoE4-NT risultante, senza tag di sequenza o code, successivamente sfugge ai batteri e si accumula nel terreno di coltura11,12, semplificando l'elaborazione a valle.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

Il termine nanodisco si riferisce a un tipo discreto di nanoparticella composto da un lipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e un agente bioattivo integrato. I nanodischi sono organizzati come un doppio strato lipidico a forma di disco il cui perimetro è circoscritto dalla proteina dell'impalcatura, di solito un membro della famiglia delle apolipoproteine scambiabili. Numerosi agenti bioattivi idrofobici sono stati solubilizzati in modo efficiente in nanodischi mediante la loro integrazione nell'ambiente idrofobico del doppio strato lipidico della particella, producendo una popolazione ampiamente omogenea di particelle nell'intervallo di 10-20 nm di diametro. La formulazione di nanodischi richiede un rapporto preciso dei singoli componenti, un'aggiunta sequenziale appropriata di ciascun componente, seguita dalla sonicazione a bagno della miscela di formulazione. La proteina dello scaffold anfipatico contatta spontaneamente e riorganizza il doppio strato disperso formando una miscela di agenti lipidici / bioattivi per formare una popolazione discreta e omogenea di particelle di nanodischi. Durante questo processo, la miscela di reazione passa da un aspetto opaco e torbido a un campione chiarificato che, quando completamente ottimizzato, non produce precipitato dopo la centrifugazione. Gli studi di caratterizzazione riguardano la determinazione dell'efficienza di solubilizzazione dell'agente bioattivo, la microscopia elettronica, la cromatografia a filtrazione su gel, la spettroscopia di assorbanza ultravioletta visibile (UV/Vis) e/o la spettroscopia di fluorescenza. Questo è normalmente seguito da un'indagine sull'attività biologica utilizzando cellule o topi in coltura. Nel caso di nanodischi che ospitano un antibiotico (cioè l'antibiotico macrolide poliene amfotericina B), è possibile misurare la loro capacità di inibire la crescita di lieviti o funghi in funzione della concentrazione o del tempo. La relativa facilità di formulazione, la versatilità rispetto ai componenti, la dimensione delle particelle su scala nanometrica, la stabilità intrinseca e la solubilità acquosa consentono una miriade di applicazioni in vitro e in vivo della tecnologia dei nanodischi. Nel presente articolo, descriviamo una metodologia generale per formulare e caratterizzare i nanodischi contenenti amfotericina B come agente bioattivo idrofobo.

Processo di formulazione di nanodischi di agenti bioattivi Nella procedura di formulazione ampB-nanodisk descritta, la reazione è considerata completa quando l'aspetto del campione passa da torbido a chiaro (Figura 1). Questo cambiamento indica che si sono formati nanofloppy e che l'agente bioattivo è stato solubilizzato. Spesso, gli agenti bioattivi assorbono la luce nella regione della lunghezza d'onda visibile (ad esempio, ampB, curcumina, luteina, coenzima Q10<...

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Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Qui, descriviamo la produzione e la caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodisk. I nanodischi di amfotericina B sono presi come esempio per descrivere il protocollo in modo graduale.

Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Questo protocollo fornisce conoscenze pratiche, utili per formulare particelle su scala nanometrica, cioè nanodischi, che incorporano stabilmente una vasta gamma di molecole bioattive idrofobiche. Questo metodo ha molte applicazioni pratiche.La capacità di conferire solubilità acquosa a composti bioattivi altrimenti insolubili consente l'uso di nanofloppy in applicazioni di somministrazione di farmaci. Il metodo descritto è semplice. Si preferisce condurre studi alla scala descritta, cinque milligrammi di fosfolipidi, due milligrammi di proteina dell'impalcatura, in modo che la formazione di nanodischi sia prontamente monitorata mediante ispezione visiva.A dimostrare la procedura saranno Michael Karo e Matthew Swackhammer, studenti universitari ricercatori nel laboratorio Ryan. Per preparare un'aliquota fosfolipidica, pesare cinque milligrammi di DMPC e trasferirla in una provetta di vetro. Sciogliere il fosfolipide aggiungendo 300 microlitri di cloroformio e 100 microlitri di metanolo per un rapporto di tre a uno.Evaporare il solvente organico ponendo la provetta di vetro sotto un leggero flusso di azoto gassoso per 10-15 minuti, in modo tale che un sottile film di fosfolipidi essiccati si formi lungo le pareti della parte inferiore della provetta. Per formulare amfotericina B o AmpB-Nanodisks, pipettare 450 microlitri di PBS sull'aliquota fosfolipidica liofilizzata e vortice per 30 secondi per disperdere il lipide. Pipettare 50 microlitri di soluzione di AmpB da 20 milligrammi per millilitro nel campione di fosfolipidi dispersi e nel vortice.Aggiungere 500 microlitri di quattro milligrammi per millilitro di proteina scaffold ApoE4 NT alla provetta di vetro contenente il fosfolipide disperso e AmpB. Bath sonicare il campione a 24 gradi Celsius fino a quando la soluzione non si chiarisce. Per la dialisi AmpB-Nanodisk, preparare una sezione di tubo di dialisi immergendolo accuratamente in acqua deionizzata distillata per 10 minuti.Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che nessun liquido possa fuoriuscire. Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e trasferire il campione di AmpB-Nanodisk nel tubo di dialisi. Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente tampone PBS da un litro appena preparato. Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione al minimo, assicurandosi di non produrre un vortice. Consentire la dialisi per continuare durante la notte a quattro gradi Celsius.Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione e collegarlo a un computer di supporto corrispondente premendo Controllo PC. Sul computer di supporto, aprire il software etichettato UVProbe 2.61 e connettersi allo spettrofotometro facendo clic su "connetti" nell'angolo in basso a sinistra. Fare clic sullo spettro, quindi fare clic su "metodo" nella barra degli strumenti in alto.Fare clic sulla scheda di misurazione e immettere 500 nella casella di testo iniziale" situata sotto l'intervallo di lunghezze d'onda e 300 nella casella di testo "fine". Fare clic sul menu a discesa accanto alla scheda "velocità di scansione" e impostarlo su medio. Preparare un campione bianco trasferendo un millilitro di DMSO in due cuvette di quarzo.Caricare entrambe le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro. Fare clic su "spazio vuoto automatico" e registrare uno spettro da 300 a 500 nanometri facendo clic su "start" nell'angolo in basso a sinistra. Per l'analisi spettrale standard AmpB, rimuovere la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungere 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione madre AmpB.Caricare nuovamente la cuvetta nella scheda campione e fare clic su "start" per registrare l'assorbanza del campione. Dopo aver registrato l'assorbanza del campione, rimuovere la cuvetta e decantare il contenuto liquido in un contenitore per i rifiuti. Risciacquare accuratamente la cuvetta con tre lavaggi di acqua deionizzata, seguiti da tre lavaggi con etanolo al 70%.Per l'analisi spettrale di AmpB-Nanodisk interrotto, preparare il campione pipettando 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di AmpB-Nanodisk stock in un millilitro di DMSO e incubare per un minuto prima di registrare lo spettro. Caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione e fare clic su "start" per registrare l'assorbanza del campione. Per l'analisi spettrale di un bianco tampone PBS, preparare un bianco trasferendo un millilitro di PBS in due cuvette di quarzo.Caricare le cuvette nella porta del campione. Fare clic su "vuoto automatico" e registrare lo spettro da 300 a 500 nanometri. Per l'analisi spettrale di un campione di AmpB-Nanodisk non interrotto, rimuovere la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungere 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di campione di AmpB-Nanodisk nel buffer PBS.Caricare nuovamente la cuvetta nella scheda campione. Fare clic su Start" e registrare lo spettro del campione. La reazione di formulazione AmpB-Nanodisk è considerata completa quando l'aspetto del campione passa da torbido a chiaro.Viene mostrata la spettroscopia di assorbimento visibile UV di campioni di AmpB in DMSO e PBS. Nel DMSO sono stati osservati tre distinti massimi di assorbanza a 372, 392 e 415 nanometri, picchi indicativi di AmpB. Gli spettri di assorbanza dei nanodischi AmpB in PBS hanno mostrato un singolo picco di assorbanza maggiore a una lunghezza d'onda più corta.In confronto, gli spettri di assorbanza degli AmpB-Nanodisk nel DMSO apparivano simili agli spettri degli AmpB di serie. L'attività biologica di AmpB-Nanodisks è stata eseguita valutando i saggi di inibizione della crescita del lievito. Campioni di controllo come PBS, DMSO e lipoproteine ad alta densità ricostituite hanno dimostrato che i componenti dei nanodischi diversi dall'AmpB non hanno alcun effetto visibile sulla crescita del lievito.Il controllo positivo ha confermato che AmpB è un inibitore efficiente della crescita del lievito. Nel caso dei nanodischi AmpB, è stata osservata un'attività di inibizione della crescita dipendente dalla concentrazione. Non tutti i preparati di nanodisk sono uguali.Alcuni possono richiedere più tempo, lipidi diversi o diverse proteine dell'impalcatura. Esse sono solo indistinguibili è la chiarificazione del campione di nanodisk. Questa tecnica ha portato a nuove nanoparticelle utilizzate per studiare la cardiotossicità indotta da doxorubicina, l'apoptosi, le interazioni dei ligandi e ha fornito numerose molecole bioattive insolubili acquose, tra cui luteina e curcumina.

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