Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
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この研究は、国立衛生研究所(R37 HL-64159)からの助成金によってサポートされました。

1. 足場タンパク質成分の変換・発現・精製
<ol><li>apoE4-NT含有プラスミドによるBL21細菌形質転換<ol><li>BL21(DE3)コンピテントセルのチューブを氷上で10分間解凍します。</li>
		<li>すべての氷が溶けたら、50 μLの細胞を氷上の形質転換チューブに穏やかに注意深くピペットで混ぜます。</li>
		<li>50 ngのプラスミドDNA(配列については、 補足表1を参照)を含む5 μLを細胞混合物?...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

ナノディスクを含む生理活性剤の製剤化は、そうでなければ不溶性の疎水性化合物を可溶化するための便利な方法を提供する。生成物の生理活性物質ナノディスクは水性媒体に完全に溶解するため、広範囲の疎水性分子に対する有用な送達方法を提供します(表1)。これらには、小分子、天然および合成薬、植物栄養素、ホルモンなどが含まれます。製剤戦略は通常、有機溶媒へ?...

新生円盤状高密度リポタンパク質(HDL)は、ヒト循環器系に存在するはるかに豊富な球状HDLの天然に存在する前駆細胞です。プレβHDLとも呼ばれるこれらの新生粒子は、独特で独特の構造特性を持っています1。実際、新生HDLは回転楕円体粒子として存在するのではなく、円盤状です。天然および再構成された円盤状HDLに関する広範な構造特性評価研究は、それらがアポA-Iなどの両親媒性交換可能なアポリポタンパク質(apo)によって周囲が外接するリン脂質二重層で構成されていることを明らかにしました。ヒトリポタンパク質代謝では、循環新生HDLは末梢細胞から脂質を生成し、ATP結合カセットトランスポーターA1やレシチン:コレステロールアシルトランスファーゼ2などの主要なタンパク質メディエーターに依存するプロセスで球状HDLに成熟します。このプロセスは、心臓病に対して保護的であると考えられているコレステロール逆輸送経路の重要な要素を表しています。この知識と円盤状HDLを再構成する能力を武器に、研究者はこれらの粒子をアテローム性動脈硬化症を治療するための治療的介入として採用しました3。本質的に、再構成されたHDL(rHDL)を患者に注入すると、プラーク沈着物からのコレステロール流出が促進され、胆汁酸への変換と体内からの排泄のために肝臓に戻されます。いくつかのバイオテクノロジー/製薬会社がこの治療戦略を追求しています4。
同時に、実験室でこれらの粒子を生成する能力は、新しいアプリケーションと新しい技術につながる研究活動の急増を引き起こしました。顕著な用途の1つは、天然様環境で膜貫通タンパク質を収容するためのミニチュアメンブレンとしてのrHDL粒子の使用です5。現在までに、何百ものタンパク質が円盤状rHDLにうまく取り込まれており、これらのタンパク質が受容体、酵素、トランスポーターなどとして天然の立体構造と生物学的活性の両方を保持していることが研究によって実証されています。「ナノディスク」と呼ばれるこれらの粒子は、多くの場合、高解像度で構造特性評価に適していることも示されています6。膜貫通タンパク質の研究に対するこのアプローチは、界面活性剤ミセルやリポソームを用いた研究よりも優れていると認識されており、その結果、急速に進歩しています。rHDLを形成することができる2つの異なる方法が報告されていることを認識することが重要です。「コール酸透析」法13 は、rHDL二重層5における膜貫通タンパク質の取り込みに関連する用途に普及している。本質的に、この製剤化方法は、界面活性剤コール酸ナトリウム(またはデオキシコール酸ナトリウム;ミセル分子量[MW]4,200Da)を含む緩衝液中で、リン脂質、足場タンパク質、および目的の膜貫通タンパク質を形成する二重層を混合することを含む。界面活性剤はさまざまな反応成分を効果的に可溶化し、界面活性剤が不足しているバッファーに対してサンプルを透析することができます。透析ステップでは、サンプルから界面活性剤が除去されると、rHDLが自発的に形成されます。このアプローチを使用して目的の膜貫通タンパク質をトラップする場合、生成物粒子はナノディスク5と呼ばれます。しかしながら、この方法を使用して低分子疎水性生物活性剤(MW <1,000 Da)を組み込む試みは、ほとんど成功していない。膜貫通タンパク質とは異なり、低分子生理活性物質は界面活性剤とともに透析バッグから逃げることができるため、rHDLへの取り込み効率が大幅に低下します。この問題は、配合混合物14から洗剤を省略することによって解決された。代わりに、成分は水性緩衝液に順次添加され、二重層形成脂質から始まり、ナノディスクと呼ばれるrHDLを含む安定な生理活性物質を形成する。その他は、 インビボ イメージング剤7の取り込みおよび輸送のためにrHDLを使用している。最近では、アポリポタンパク質足場とアニオン性グリセロリン脂質であるカルジオリピンからなる特殊なrHDLがリガンド結合研究に採用されています。これらの粒子は、カルジオリピンとカルシウム、シトクロムc、および抗癌剤ドキソルビシン8を含む様々な水溶性リガンドとの相互作用の研究のためのプラットフォームを提供する。
本研究の焦点は、安定に組み込まれた疎水性生理活性物質(すなわちナノディスク)を有するrHDLの製剤化にある。これらの薬剤が円盤状rHDL粒子の脂質環境に統合する能力は、それらに水溶性を効果的に付与します。このように、ナノディスクは in vivo 治療用途の可能性を秘めています。ナノディスクを製剤化する場合、個別の疎水性生物活性物質を生成物粒子にうまく取り込むためには、特定のインキュベーション/反応条件が必要であり、このレポートの目的は、特定のアプリケーションのための新規ナノディスク粒子を作成するための基礎テンプレートとして使用できる詳細な実用的な情報を提供することです。したがって、この原稿の文脈では、ナノディスクとナノディスクという用語は交換可能ではありません。ナノディスクは、その脂質二重層5に埋め込まれた膜貫通タンパク質を含むように処方されたrHDLを指すのに対し、ナノディスクという用語は、アムホテリシンB14などの低分子量(<1,000Da)疎水性生物活性剤を組み込むように処方されたrHDLを指す。
適切な足場タンパク質の獲得には、さまざまな方法が利用可能です。足場タンパク質をメーカー(apoA-I(SRP4693)やapoE4(A3234)など)から購入することは可能ですが、コストが制限要因となる場合があります。好ましいアプローチは、組換え足場タンパク質を大腸菌で発現させることである。ヒトapoA-I9、apoE410、ならびに昆虫血リンパタンパク質アポリポフォリン-III11についてのプロトコルが公開されている。本明細書に記載の実験の目的のために、組換えヒトapoE4N末端(NT)ドメイン(アミノ酸1〜183)を使用した。ヒトapoE4-NTをコードする塩基配列を合成し、ベクターコードされたpelBリーダー配列に直接隣接するpET-22b(+)発現ベクターに挿入した。この構築物は、pelBリーダー配列-apoE4-NT融合タンパク質の発現をもたらす。タンパク質合成に続いて、細菌のpelBリーダー配列は、新しく合成されたタンパク質をペリプラズム空間に誘導し、そこでリーダーペプチダーゼがpelB配列を切断します。得られたapoE4-NTタンパク質は、配列タグや尾部を持たず、その後細菌を逃がして培養培地11,12に蓄積し、下流の処理を簡素化します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

ナノディスクという用語は、二重層形成脂質、足場タンパク質、および統合された生理活性物質からなる離散型のナノ粒子を指す。ナノディスクは、円盤状の脂質二重層として編成され、その周囲は足場タンパク質、通常は交換可能なアポリポタンパク質ファミリーのメンバーによって外接される。多数の疎水性生物活性剤は、粒子の脂質二重層の疎水性環境への集積によってナノディスクに効率的に可溶化され、直径10〜20nmの範囲の粒子のほぼ均質な集団をもたらした。ナノディスクの製剤化は、個々の成分の正確な比率、各成分の適切な順次添加、続いて製剤混合物の浴超音波処理を必要とする。両親媒性足場タンパク質は、分散した二重層に自発的に接触して再編成し、脂質/生物活性物質混合物を形成して、離散的で均質なナノディスク粒子の集団を形成します。このプロセス中に、反応混合物は不透明で濁った外観から清澄化されたサンプルに移行し、完全に最適化されると、遠心分離時に沈殿物を生成しません。特性評価研究には、生物活性物質の可溶化効率、電子顕微鏡、ゲルろ過クロマトグラフィー、紫外可視(UV/Vis)吸光度分光法、および/または蛍光分光法の決定が含まれます。その後、通常、培養細胞やマウスを用いた生物活性の調査が行われます。抗生物質(すなわち、マクロライドポリエン系抗生物質アムホテリシンB)を保持するナノディスクの場合、濃度または時間の関数として酵母または真菌の増殖を阻害するそれらの能力を測定することができる。製剤化の相対的な容易さ、構成部品に対する汎用性、ナノスケールの粒子サイズ、固有の安定性、および水性溶解性により、ナノディスク技術の無数のin vitro および in vivo アプリケーションが可能になります。本稿では、疎水性生理活性剤としてアムホテリシンBを含むナノディスクを定式化し、特性評価するための一般的な方法論について説明します。

生理活性物質ナノディスク製剤化プロセス 説明したampB-nanodiskの製剤化手順では、サンプルの外観が濁った状態から透明な状態に移行すると、反応は完了したと見なされます(図1)。この変化は、ナノディスクが形成され、生理活性物質が可溶化されたことを示している。多くの場合、生物活性物質は可視波長領域の光(例えば、ampB、クルクミン、ルテイン?...

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Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

ここでは、ナノディスクを含む生理活性剤の製造と特性評価について説明します。アムホテリシンBナノディスクは、プロトコルを段階的に記述するための例として取り上げられています。

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

このプロトコルは、広範囲の疎水性生理活性分子を安定して組み込んだナノスケールの粒子、すなわちナノディスクを処方するのに役立つ実用的な知識を提供します。この方法は多くの実用的な用途があります。他の方法では不溶性の生理活性化合物に水溶性を付与する能力は、薬物送達アプリケーションにおけるナノディスクの使用を可能にする。説明されている方法は簡単です。ナノディスクの形成が目視検査によって容易にモニターされるように、記載されたスケール、5ミリグラムのリン脂質、2ミリグラムの足場タンパク質で研究を行うことが好ましい。手順を実演するのは、ライアン研究室の学部生研究者であるマイケル・カロとマシュー・スワックハマーです。リン脂質アリコートを調製するには、5ミリグラムのDMPCを計量し、ガラス試験管に移します。300マイクロリットルのクロロホルムと100マイクロリットルのメタノールを3対1の比率で添加することにより、リン脂質を溶解します。ガラス試験管を窒素ガスの穏やかな流れの下に10〜15分間置き、乾燥したリン脂質の薄膜が管の底部の壁に沿って形成されるようにして、有機溶媒を蒸発させます。アムホテリシンBまたはAmpB-ナノディスクを製剤化するには、450マイクロリットルのPBSを凍結乾燥リン脂質アリコートにピペットで送り、30秒間ボルテックスして脂質を分散させます。50マイクロリットルの20ミリグラムあたり20ミリグラムのストックAmpB溶液を分散したリン脂質試料およびボルテックスにピペットする。分散したリン脂質とAmpBを含むガラス試験管に500マイクロリットルの4ミリグラムあたり4ミリグラムのApoE4 NT足場タンパク質を追加します。溶液が明確になるまで、摂氏24度でサンプルを超音波処理します。AmpB-Nanodisk透析の場合は、透析チューブを蒸留脱イオン水に10分間十分に浸して、透析チューブのセクションを準備します。透析チューブクランプを使用して、浸した透析チューブの一端をクランプし、液体が逃げないようにします。細いネック漏斗を透析チューブの開放端に挿入し、AmpB-Nanodiskサンプルを透析チューブに移します。漏斗を取り外し、クランプします 透析チューブの端を別の透析チューブクランプで。透析チューブの密閉された端の1つにフォーム透析フロートを置き、組み立てた透析チューブを新しく準備した1リットルのPBSバッファーを含むビーカーに入れます。ビーカーの底に磁気攪拌子を置き、攪拌制御を低く調整して、渦が発生しないようにします。透析を摂氏4度で一晩継続させます。電源スイッチを切り替えて分光光度計の電源を入れ、PCコントロールを押して対応するサポートコンピューターに接続します。サポートコンピューターで、UVProbe 2.61というラベルの付いたソフトウェアを開き、左下隅にある[接続]をクリックして分光光度計に接続します。スペクトルをクリックしてから、上部のツールバーの「方法」をクリックします。測定タブをクリックし、波長範囲の下にある「開始」テキストボックスに500を入力し、終了テキストボックスに300を入力します。[スキャン速度]というラベルの付いたタブの横にあるドロップダウンメニューをクリックし、中に設定します。1ミリリットルのDMSOを2つの石英キュベットに移してサンプルブランクを準備します。両方のキュベットを分光光度計のそれぞれのサンプルポートにロードします。クリック自動ブランク」をクリックし、左下隅にある[開始]をクリックして300〜500ナノメートルのスペクトルを記録します。AmpB標準スペクトル分析の場合は、前面サンプルポートからキュベットを取り出し、1ミリリットルあたり1ミリグラムのAmpBストック溶液を20マイクロリットル加えます。キュベットをサンプルボードに戻し、「開始」をクリックしてサンプルの吸光度を記録します。サンプルの吸光度を記録した後、キュベットを取り出し、液体内容物を廃棄物容器にデカントします。キュベットを脱イオン水で3回洗浄した後、70%エタノールで3回洗浄します。破壊されたAmpB-ナノディスクのスペクトル分析では、1ミリリットルのAmpB-ナノディスクストックあたり20マイクロリットルを1ミリリットルのDMSOにピペッティングしてサンプルを調製し、スペクトルを記録する前に1分間インキュベートします。キュベットを前面のサンプルポートにロードし、[開始]をクリックしてサンプルの吸光度を記録します。PBSバッファーブランクのスペクトル分析では、1ミリリットルのPBSを2つの石英キュベットに移してブランクを調製します。キュベットをサンプルポートにロードします。自動ブランク」をクリックし、300〜500ナノメートルのスペクトルを記録します。破壊されていないAmpBナノディスクサンプルのスペクトル分析では、前面のサンプルポートからキュベットを取り出し、1ミリリットルあたり1ミリグラムのAmpBナノディスクサンプルを20マイクロリットルPBSバッファーに追加します。キュベットをサンプルボードに戻します。クリック開始」サンプルスペクトルを記録します。AmpB-Nanodisk製剤反応は、サンプルの外観が濁った状態から透明な状態に移行すると完了したと見なされます。DMSOおよびPBS中のAmpBサンプルの紫外可視吸収分光法が示されています。DMSOでは、AmpBを示すピークである372、392、および415ナノメートルに3つの特徴的な吸光度の極大が観察されました。PBS中のAmpBナノディスクの吸光度スペクトルは、より短い波長で単一の主要な吸光度ピークを示しました。比較すると、DMSO中のAmpBナノディスクの吸光度スペクトルは、ストックAmpBのスペクトルと類似しているように見えました。AmpB-ナノディスクの生物学的活性は、酵母増殖阻害アッセイを評価することによって行われた。PBS、DMSO、再構成高密度リポタンパク質などの対照サンプルは、AmpB以外のナノディスク成分が酵母の成長に識別可能な影響を与えないことを示しました。ポジティブコントロールは、AmpBが酵母増殖の効率的な阻害剤であることを確認しました。AmpB-Nanodisksの場合、濃度依存的な増殖阻害活性が認められた。すべてのナノディスク製剤が同じというわけではありません。いくつかは、より多くの時間、異なる脂質、または異なる足場タンパク質を必要とするかもしれません。それらは不明瞭なだけです}ナノディスクサンプルの清澄化です。この技術は、ドキソルビシン誘発性心毒性、アポトーシス、リガンド相互作用の研究に使用される新しいナノ粒子をもたらし、ルテインやクルクミンを含む多数の水性不溶性生理活性分子を送達しました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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