Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
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이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health) (R37 HL-64159)의 보조금으로 지원되었습니다.

1. 스캐폴드 단백질 성분의 형질전환, 발현 및 정제
<ol><li>플라스미드를 함유하는 apoE4-NT를 이용한 BL21 박테리아 형질전환<ol><li>BL21(DE3) 유능한 세포 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 해동합니다.</li>
		<li>모든 얼음이 녹으면 50μL의 세포를 얼음 위의 형질 전환 튜브에 부드럽고 조심스럽게 피펫으로 혼합합니다.</li>
		<li>50ng의 플라스미드 DNA를 함유하는 5μL(서열은 보충 표 1 ?...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형은 달리 불용성인 소수성 화합물을 가용화하는 편리한 방법을 제공한다. 생성물 생리활성제 나노디스크는 수성 매질에 완전히 용해되기 때문에 광범위한 소수성 분자에 대한 유용한 전달 방법을 제공합니다(표 1). 여기에는 소분자, 천연 및 합성 약물, 식물 영양소, 호르몬 등이 포함됩니다. 제형 전략은 일반적으로 유기 용매에서 생리 활성?...

초기 원반형 고밀도 지단백질(HDL)은 인간 순환계에 존재하는 훨씬 더 풍부한 구형 HDL의 자연 발생 전구체입니다. pre-ß HDL이라고도 하는 이러한 초기 입자는 독특하고 독특한 구조적 특성을 가지고 있습니다1. 실제로, 초기 HDL은 구상 입자로 존재하는 것이 아니라 디스크 모양입니다. 자연 및 재구성 원반형 HDL에 대한 광범위한 구조적 특성화 연구는 주변이 apoA-I와 같은 양친매성 교환 가능한 아포지단백(apo)으로 둘러싸인 인지질 이중층으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 인간 지단백질 대사에서 순환하는 초기 HDL은 말초 세포에서 지질을 축적하고 ATP 결합 카세트 수송체 A1 및 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼제2를 포함한 주요 단백질 매개체에 의존하는 과정에서 구형 HDL로 성숙합니다. 이 과정은 심장 질환을 예방하는 것으로 간주되는 역 콜레스테롤 수송 경로의 중요한 구성 요소를 나타냅니다. 이러한 지식과 원반형 HDL을 재구성할 수 있는 능력으로 무장한 연구자들은 이러한 입자를 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 치료적 중재로 사용했다3. 본질적으로, 환자에게 재구성 된 HDL (rHDL)을 주입하면 플라크 침전물에서 콜레스테롤 유출을 촉진하고 담즙산으로 전환하고 신체에서 배설하기 위해 간으로 되돌립니다. 여러 생명공학/제약회사들이 이 치료 전략을 추구하고 있다4.
동시에 실험실에서 이러한 입자를 생성하는 능력은 새로운 응용 분야와 새로운 기술로 이어진 연구 활동을 촉발했습니다. 한 가지 두드러진 응용 분야는 rHDL 입자를 미니어처 멤브레인으로 사용하여 네이티브와 같은 환경에서 막횡단 단백질을 수용하는 것입니다5. 현재까지 수백 개의 단백질이 원반형 rHDL에 성공적으로 통합되었으며 연구에 따르면 이러한 단백질은 수용체, 효소, 수송체 등과 같은 기본 형태와 생물학적 활성을 모두 유지합니다. "나노디스크(nanodiscs)"라고 불리는 이 입자들은 종종 고분해능(high resolution)에서 구조적 특성화에 적합한 것으로 나타났다6. 막횡단 단백질 조사에 대한 이러한 접근 방식은 세제 미셀이나 리포솜을 사용한 연구보다 우수한 것으로 인식되고 있으며 그 결과 빠르게 발전하고 있습니다. rHDL을 형성할 수 있는 두 가지 별개의 방법이 보고되었음을 인식하는 것이 중요합니다. "콜레이트 투석" 방법(13 )은 rHDL 이중층(5)에 막횡단 단백질을 혼입시키는 것과 관련된 응용에 널리 사용된다. 본질적으로, 이러한 제형 방법은 세제인 소듐 콜레이트 (또는 소듐 데옥시콜레이트; 4,200 Da의 미셀 분자량 [MW])를 함유하는 완충제에서 이중층 형성 인지질, 스캐폴드 단백질, 및 관심있는 막횡단 단백질을 혼합하는 것을 포함한다. 세제는 다양한 반응 성분을 효과적으로 용해시켜 세제가 부족한 완충액에 대해 시료를 투석할 수 있도록 합니다. 투석 단계에서 세제가 샘플에서 제거됨에 따라 rHDL이 자발적으로 형성됩니다. 이 접근법이 관심 있는 막횡단 단백질을 포획하는 데 사용될 때, 생성물 입자는 나노디스크(nanodisc)5라고 불린다. 그러나 이 방법을 사용하여 소분자 소수성 생리활성제(MW<1,000Da)를 통합하려는 시도는 대체로 성공적이지 못했습니다. 막횡단 단백질과 달리 저분자 생리활성제는 세제와 함께 투석 백에서 빠져나갈 수 있어 rHDL로의 결합 효율을 크게 감소시킵니다. 이 문제는 배합혼합물(14)에서 세제를 생략함으로써 해결되었다. 대신에, 성분들은 지질을 형성하는 이중층으로부터 시작하여, 나노디스크로 지칭되는 rHDL을 함유하는 안정한 생리활성제를 형성하면서, 수성 완충액에 순차적으로 첨가된다. 다른 연구자들은 생체 내 이미징 에이전트의 혼입 및 수송을 위해 rHDL을 사용했다7. 보다 최근에는 아포지단백 스캐폴드와 음이온성 글리세로인지질인 카디오리핀으로 구성된 특수 rHDL이 리간드 결합 연구에 사용되었습니다. 이 입자는 카디오리핀과 칼슘, 시토크롬 c, 항암제인 독소루비신을 포함한 다양한 수용성 리간드의 상호작용을 연구하기 위한 플랫폼을 제공한다8.
본 연구의 초점은 안정적으로 통합된 소수성 생리활성제(즉, 나노디스크)를 보유하는 rHDL의 제형에 있습니다. 원반형 rHDL 입자의 지질 환경에 통합하는 이러한 제제의 능력은 효과적으로 수용성을 부여합니다. 따라서 나노디스크는 생체 내 치료 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 나노디스크를 제조할 때, 분리된 소수성 생리활성제를 제품 입자에 성공적으로 통합하기 위해서는 특정 배양/반응 조건이 필요하며, 이 보고서의 목표는 특정 응용 분야를 위한 새로운 나노디스크 입자를 만들기 위한 기본 템플릿으로 사용할 수 있는 상세한 실용적인 정보를 제공하는 것입니다. 따라서 이 원고의 맥락에서 나노디스크와 나노디스크라는 용어는 서로 바꿔 사용할 수 없습니다. 나노디스크는 그의 지질 이중층(5)에 매립된 막횡단 단백질을 함유하도록 제형화된 rHDL을 의미하는 반면, 나노디스크라는 용어는 암포테리신B14와 같은 저분자량(< 1,000Da) 소수성 생리활성제를 혼입하도록 제형화된 rHDL을 의미한다.
적합한 스캐폴드 단백질의 획득을 위해 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 스캐폴드 단백질을 제조업자로부터 구입할 수 있지만[예를 들어, apoA-I (SRP4693) 또는 apoE4 (A3234)], 그러나 비용이 제한 요인이 될 수 있다. 바람직한 접근법은 대장균에서 재조합 스캐폴드 단백질을 발현하는 것이다. 인간 apoA-I9, apoE410 및 곤충 체액 림프 단백질 apolipophorin-III11에 대한 프로토콜이 발표되었습니다. 본원에 기재된 실험의 목적을 위해, 재조합 인간 apoE4 N-말단 (NT) 도메인 (아미노산 1-183)을 사용하였다. 인간 apoE4-NT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 합성하여 벡터-코딩된 pelB 리더 서열에 직접 인접한 pET-22b(+) 발현 벡터에 삽입하였다. 이러한 구축물은 pelB 리더 서열-apoE4-NT 융합 단백질의 발현을 유도한다. 단백질 합성 후, 박테리아 pelB 리더 서열은 새로 합성된 단백질을 리더 펩티다아제가 pelB 서열을 절단하는 주변세포질 공간으로 유도합니다. 서열 태그 또는 꼬리가 없는 생성된 apoE4-NT 단백질은 이후 박테리아를 빠져나와 배양 배지11,12에 축적되어 다운스트림 처리를 단순화합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

나노디스크라는 용어는 이중층 형성 지질, 스캐폴드 단백질 및 통합 생리활성제로 구성된 개별 유형의 나노입자를 의미합니다. 나노 디스크는 디스크 모양의 지질 이중층으로 구성되며, 그 둘레는 스캐 폴드 단백질, 일반적으로 교환 가능한 아포지 단백질 계열의 구성원으로 둘러싸여 있습니다. 수많은 소수성 생리활성제는 입자의 지질 이중층의 소수성 환경에 통합되어 나노디스크에서 효율적으로 용해되어 직경 10-20nm 범위의 대체로 균질한 입자 집단을 생성합니다. 나노 디스크의 제형은 개별 성분의 정확한 비율, 각 성분의 적절한 순차적 첨가, 제형 혼합물의 목욕 초음파 처리가 필요합니다. 양친매성 스캐폴드 단백질은 분산된 이중층 형성 지질/생리활성제 혼합물을 자발적으로 접촉하고 재구성하여 나노디스크 입자의 분리되고 균질한 집단을 형성합니다. 이 과정에서 반응 혼합물은 불투명하고 탁한 모양에서 완전히 최적화되면 원심분리 시 침전물이 생성되지 않는 정제된 샘플로 전환됩니다. 특성화 연구에는 생리활성제 가용화 효율, 전자 현미경, 겔 여과 크로마토그래피, 자외선 가시광선(UV/Vis) 흡광도 분광법 및/또는 형광 분광법의 측정이 포함됩니다. 이것은 일반적으로 배양 된 세포 또는 마우스를 사용하여 생물학적 활성을 조사합니다. 항생제(즉, 마크로라이드 폴리엔 항생제 암포테리신 B)를 함유하는 나노디스크의 경우, 농도 또는 시간의 함수로서 효모 또는 진균의 성장을 억제하는 능력을 측정할 수 있습니다. 제형의 상대적 용이성, 구성 부품에 대한 다양성, 나노 스케일 입자 크기, 고유 안정성 및 수용성은 나노 디스크 기술의 무수한 시험관 내 및 생체 내 응용을 허용합니다. 본 논문에서, 우리는 소수성 생리활성제로서 암포테리신 B를 함유하는 나노디스크를 공식화하고 특성화하는 일반적인 방법론을 설명한다.

생리활성제 나노디스크 제형 공정 설명된 ampB-나노디스크 제형 절차에서 시료 외관이 탁한 상태에서 투명한 상태로 전환되면 반응이 완료된 것으로 간주됩니다(그림 1). 이 변화는 나노 디스크가 형성되고 생리 활성제가 가용화되었음을 나타냅니다. 종종 생리활성제는 가시광선 파장 영역(예: ampB, 커큐민, 루테인, 코엔자임 Q10)의 빛을 흡수하며, 이러?...

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Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

여기에서는 나노디스크를 포함하는 생리활성제의 생산 및 특성화에 대해 설명합니다. 암포테리신 B 나노디스크는 프로토콜을 단계적으로 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형 및 특성화

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

이 프로토콜은 광범위한 소수성 생리 활성 분자를 안정적으로 통합하는 나노 스케일 입자, 즉 나노 디스크를 공식화하는 데 유용한 실용적인 지식을 제공합니다. 이 방법에는 많은 실용적인 응용 프로그램이 있습니다.불용성 생리활성 화합물에 수용성을 부여하는 능력은 약물 전달 응용 분야에서 나노디스크의 사용을 허용합니다. 설명된 방법은 간단합니다. 나노 디스크의 형성이 육안 검사에 의해 쉽게 모니터링 될 수 있도록, 설명 된 규모, 5 밀리그램 인지질, 2 밀리그램 스캐 폴드 단백질로 연구를 수행하는 것이 바람직하다.이 절차를 시연하는 것은 Ryan 연구실의 학부생 연구원 인 Michael Karo와 Matthew Swackhammer가 될 것입니다. 인지질 분취액을 제조하기 위해, 5 밀리그램의 DMPC의 무게를 측정하고, 이를 유리 시험관에 옮긴다. 300 마이크로 리터의 클로로포름과 100 마이크로 리터의 메탄올을 3 대 1의 비율로 첨가하여 인지질을 용해시킨다.유리 시험관을 10 내지 15분 동안 질소 가스의 부드러운 스트림 하에 두어 유기 용매를 증발시키고, 건조된 인지질의 박막이 튜브의 바닥부의 벽을 따라 형성되도록 한다. 암포테리신 B 또는 AmpB 나노디스크를 제형화하기 위해, 동결건조된 인지질 분취액을 450 마이크로리터의 PBS로 피펫하고, 지질을 분산시키기 위해 30초 동안 와동시켰다. 50 마이크로리터의 20 밀리그램 스톡을 AmpB 용액을 분산된 인지질 샘플에 피펫팅하고 와동시킨다.밀리리터당 4밀리그램의 500마이크로리터 ApoE4 NT 스캐폴드 단백질을 분산된 인지질 및 AmpB를 함유하는 유리 시험관에 첨가한다. 욕조는 용액이 정화 될 때까지 섭씨 24도에서 샘플을 초음파 처리합니다. AmpB-Nanodisk 투석의 경우 투석 튜브를 증류수에 10분 동안 완전히 담가 투석 튜브 섹션을 준비합니다.투석 튜브 cl 사용amp, clamp 담근 투석 튜브의 한쪽 끝을 액체가 빠져나가지 않도록 합니다. 좁은 목 깔때기를 투석 튜브의 열린 끝에 삽입하고 AmpB-Nanodisk 샘플을 투석 튜브로 옮깁니다. 깔때기를 제거하고 clamp 다른 투석 튜브 cl로 투석 튜브의 끝을 clamp.투석 튜브의 밀봉된 끝 부분 중 하나에 폼 투석 플로트를 놓고 조립된 투석 튜브를 새로 준비된 1리터 PBS 버퍼가 들어 있는 비커에 넣습니다. 마그네틱 교반 막대를 비커 바닥에 놓고 교반 제어를 낮게 조정하여 소용돌이가 발생하지 않도록 합니다. 섭씨 4도에서 밤새 투석을 계속하십시오.전원 스위치를 뒤집어 분광 광도계를 켜고 PC 제어를 눌러 해당 지원 컴퓨터에 연결합니다. 지원 컴퓨터에서 UVProbe 2.61이라고 표시된 소프트웨어를 열고 왼쪽 하단 모서리에 있는 연결"을 클릭하여 분광 광도계에 연결합니다. 스펙트럼을 클릭한 다음 상단 도구 모음에서 방법"을 클릭합니다.측정 탭을 클릭하고 파장 범위 아래에 있는 시작 텍스트 상자에 500을 입력하고 끝 텍스트 상자에 300을 입력합니다. 스캔 속도라고 표시된 탭 옆에 있는 드롭다운 메뉴를 클릭하고 중간으로 설정합니다. 1밀리리터의 DMSO를 두 개의 석영 큐벳에 옮겨 샘플 블랭크를 준비합니다.두 큐벳을 분광 광도계의 각 샘플 포트에 로드합니다. 자동 공백을 클릭하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 300에서 500나노미터까지의 스펙트럼을 기록합니다. AmpB 표준 스펙트럼 분석의 경우 전면 샘플 포트에서 큐벳을 제거하고 밀리리터당 1밀리그램의 20마이크로리터를 추가합니다.큐벳을 샘플 보드에 다시 로드하고 시작"을 클릭하여 샘플 흡광도를 기록합니다. 샘플 흡광도를 기록한 후 큐벳을 제거하고 액체 내용물을 폐기물 용기에 디캔팅합니다. 큐벳을 탈 이온수로 3 회 세척 한 후 70 % 에탄올로 3 회 세척합니다.파괴된 AmpB-나노디스크의 스펙트럼 분석을 위해 1밀리리터당 1밀리그램의 AmpB-나노디스크 스톡 20마이크로리터를 1밀리리터의 DMSO에 피펫팅하여 샘플을 준비하고 스펙트럼을 기록하기 전에 1분 동안 배양합니다. 큐벳을 전면 샘플 포트에 로드하고 시작"을 클릭하여 샘플 흡광도를 기록합니다. PBS 버퍼 블랭크의 스펙트럼 분석을 위해, 1밀리리터의 PBS를 2개의 석영 큐벳에 옮겨 블랭크를 준비한다.큐벳을 샘플 포트에 로드합니다. 딸깍 하는 소리 자동 공백 "300에서 500 나노 미터까지의 스펙트럼을 기록하십시오. 중단되지 않은 AmpB-Nanodisk 샘플의 스펙트럼 분석을 위해 전면 샘플 포트에서 큐벳을 제거하고 밀리리터당 1밀리그램의 AmpB-Nanodisk 샘플 20마이크로리터를 PBS 버퍼에 추가합니다.큐벳을 샘플 보드에 다시 로드합니다. 딸깍 하는 소리 시작"샘플 스펙트럼을 기록합니다. AmpB-Nanodisk 제형 반응은 시료 외관이 탁한 상태에서 투명한 상태로 전환될 때 완료된 것으로 간주됩니다.DMSO 및 PBS에서 AmpB 샘플의 UV 가시광선 흡수 분광법이 도시된다. DMSO에서, 372, 392 및 415 나노미터에서 3개의 독특한 흡광도 최대값(AmpB를 나타내는 피크)이 관찰되었다. PBS에서 AmpB-Nanodisks의 흡광도 스펙트럼은 더 짧은 파장에서 단일 주요 흡광도 피크를 보여주었습니다.이에 비해 DMSO에서 AmpB-나노디스크의 흡광도 스펙트럼은 스톡 AmpB의 스펙트럼과 유사하게 나타났다. AmpB-Nanodisks의 생물학적 활성은 효모 성장 억제 분석을 평가하여 수행되었습니다. PBS, DMSO 및 재구성 된 고밀도 지단백질과 같은 대조군 샘플은 AmpB 이외의 나노 디스크 성분이 효모 성장에 눈에 띄는 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했습니다.양성 대조군은 AmpB가 효모 성장의 효율적인 억제제임을 확인했습니다. AmpB-Nanodisks의 경우, 농도 의존적 성장 억제 활성이 관찰되었다. 모든 나노디스크 준비가 동일한 것은 아닙니다.일부는 더 많은 시간, 다른 지질 또는 다른 스캐폴드 단백질이 필요할 수 있습니다. They only indistinct}는 나노디스크 샘플의 설명입니다. 이 기술은 독소루비신 유도 심장 독성, 세포 사멸, 리간드 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 새로운 나노 입자로 이어졌으며 루테인 및 커큐민을 포함한 수많은 수성 불용성 생리 활성 분자를 전달했습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

연구

생화학

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...