Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health (R37 HL-64159).

1. Transformasjon, ekspresjon og rensing av stillasproteinkomponent
<ol><li>BL21 bakteriell transformasjon med apoE4-NT som inneholder plasmid<ol><li>Tine et rør med BL21 (DE3) kompetente celler på is i 10 minutter.</li>
		<li>Når all isen har smeltet, blander du forsiktig og forsiktig 50 μL av cellene inn i et transformasjonsrør på is.</li>
		<li>Tilsett 5 μL inneholdende 50 ng plasmid-DNA (for sekvens, se tilleggstabell 1) til celleblandingen. Knips forsiktig på røret fire e...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

Formulering av et bioaktivt middel som inneholder nanodisker gir en praktisk metode for å oppløse ellers uoppløselige hydrofobe forbindelser. Fordi produktets bioaktive middel nanodisker er fullt oppløselige i vandige medier, gir de en nyttig leveringsmetode for et bredt spekter av hydrofobe molekyler (tabell 1). Disse inkluderer små molekyler, naturlige og syntetiske stoffer, fytokjemikalier, hormoner, etc. Formuleringsstrategien følger vanligvis en standardprotokoll som må ta hensyn til løselig...

Begynnende diskoidale lipoproteiner med høy tetthet (HDL) er naturlig forekommende forfedre til den langt mer omfattende sfæriske HDL som er tilstede i det menneskelige sirkulasjonssystemet. Disse gryende partiklene, også referert til som pre-ß HDL, har unike og karakteristiske strukturelle egenskaper1. Faktisk, i stedet for å eksistere som en sfærisk partikkel, er begynnende HDL diskformet. Omfattende strukturelle karakteriseringsstudier på naturlige og rekonstituerte diskoidale HDL har avslørt at de består av et fosfolipid-dobbeltlag hvis omkrets er omskrevet av et amfipatisk utskiftbart apolipoprotein (apo), slik som apoA-I. I human lipoproteinmetabolisme påløper sirkulerende begynnende HDL lipider fra perifere celler og modnes til sfæriske HDL i en prosess som er avhengig av viktige proteinmediatorer, inkludert ATP-bindende kassetttransportør A1 og lecitin: kolesterolacyltransferse2. Denne prosessen representerer en kritisk komponent i den omvendte kolesteroltransportveien som anses å være beskyttende mot hjertesykdom. Bevæpnet med denne kunnskapen og evnen til å rekonstituere diskoide HDL, har forskere ansatt disse partiklene som et terapeutisk inngrep for å behandle aterosklerose3. I hovedsak fremmer infusjon av rekonstituert HDL (rHDL) hos pasienter kolesterolutstrømning fra plakkavleiringer og returnerer det til leveren for omdannelse til gallsyrer og utskillelse fra kroppen. Flere bioteknologi/farmasøytiske selskaper følger denne behandlingsstrategien4.
Samtidig har evnen til å generere disse partiklene i laboratoriet utløst en mengde forskningsaktiviteter som har ført til nye applikasjoner og ny teknologi. En fremtredende applikasjon innebærer bruk av rHDL-partikler som en miniatyrmembran for å huse transmembranproteiner i et innfødt-lignende miljø5. Hittil har hundrevis av proteiner blitt vellykket inkorporert i diskoidal rHDL, og forskning har vist at disse proteinene beholder både innfødt konformasjon og biologisk aktivitet som reseptorer, enzymer, transportører, etc. Disse partiklene, referert til som "nanodiscs", har også vist seg å være mottagelige for strukturell karakterisering, ofte ved høy oppløsning6. Denne tilnærmingen til undersøkelser av transmembranproteiner er anerkjent som overlegen studier med vaskemiddelmiceller eller liposomer, og som et resultat utvikler seg raskt. Det er viktig å erkjenne at to forskjellige metoder har blitt rapportert som er i stand til å danne en rHDL. "Kolatdialyse" -metoden13 er populær for applikasjoner relatert til inkorporering av transmembranproteiner i rHDL-dobbeltlaget5. I hovedsak innebærer denne formuleringsmetoden å blande et dobbeltlag som danner fosfolipid, et stillasprotein og transmembranproteinet av interesse i en buffer som inneholder vaskemiddelet natriumkolat (eller natriumdeoksykolat; micelle molekylvekt [MW] på 4,200 Da). Vaskemiddelet løser effektivt de forskjellige reaksjonskomponentene, slik at prøven kan dialyseres mot buffer som mangler vaskemiddel. Under dialysetrinnet, når vaskemiddelet fjernes fra prøven, dannes det spontant en rHDL. Når denne tilnærmingen brukes til å fange et transmembranprotein av interesse, har produktpartiklene blitt kalt nanodiscs5. Forsøk på å bruke denne metoden til å inkorporere småmolekylære hydrofobe bioaktive midler (MW <1000 Da) har imidlertid stort sett vært mislykket. I motsetning til transmembranproteiner, er bioaktive midler med små molekyler i stand til å unnslippe fra dialyseposen sammen med vaskemiddelet, noe som reduserer innlemmelseseffektiviteten i rHDL. Dette problemet ble løst ved å utelate vaskemidler fra formuleringsblandingen14. I stedet blir komponentene tilsatt til en vandig buffer sekvensielt, som begynner med dobbeltlaget som danner lipid, og danner et stabilt bioaktivt middel som inneholder rHDL, referert til som en nanodisk. Andre har brukt rHDL for inkorporering og transport av in vivo bildebehandlingsmidler7. Mer nylig har spesialisert rHDL bestående av et apolipoproteinstillas og den anioniske glycerofosfolipiden, kardiolipin, blitt brukt i ligandbindingsstudier. Disse partiklene gir en plattform for studier av interaksjonen mellom kardiolipin og forskjellige vannløselige ligander, inkludert kalsium, cytokrom c og anticancermidlet doksorubicin8.
Fokus for denne studien er på formuleringen av rHDL som har et stabilt innlemmet hydrofobt bioaktivt middel (dvs. nanodisk). Evnen til disse midlene til å integrere seg i lipidmiljøet av diskoidale rHDL-partikler gir dem effektivt vandig oppløselighet. Som sådan har nanodisker potensialet for in vivo terapeutiske applikasjoner. Ved formulering av nanodisker er det nødvendig med spesifikke inkubasjons- / reaksjonsbetingelser for å lykkes med å inkorporere diskrete hydrofobe bioaktive stoffer i produktpartikkelen, og målet med denne rapporten er å gi detaljert praktisk informasjon som kan brukes som en grunnleggende mal for å skape nye nanodiskpartikler for spesifikke applikasjoner. I sammenheng med dette manuskriptet er begrepene nanodisc og nanodisk derfor ikke utskiftbare. Mens nanodisc refererer til en rHDL formulert for å inneholde et transmembranprotein innebygd i lipid-dobbeltlag5, refererer begrepet nanodisk til en rHDL formulert for å innlemme lavmolekylære (< 1,000 Da) hydrofobe bioaktive midler, slik som amfotericin B14.
En rekke metoder er tilgjengelige for oppkjøp av egnede stillasproteiner. Det er mulig å kjøpe stillasproteiner fra produsenter [f.eks. apoA-I (SRP4693) eller apoE4 (A3234)], men kostnaden kan være en begrensende faktor. En foretrukket tilnærming er å uttrykke rekombinante stillasproteiner i Escherichia coli. Protokoller publiseres for humant apoA-I9, apoE410, samt insekthemolymfeproteinet apolipophorin-III11. For formålet med forsøkene beskrevet her ble rekombinant humant apoE4 N-terminal (NT) domene (aminosyrer 1-183) brukt. Nukleotidsekvensen som koder for human apoE4-NT ble syntetisert og satt inn i en pET-22b (+) ekspresjonsvektor rett ved siden av den vektorkodede pelB-ledersekvensen. Denne konstruksjonen fører til uttrykket av et pelB-ledersekvens-apoE4-NT-fusjonsprotein. Etter proteinsyntese leder bakteriell pelB-ledersekvens det nylig syntetiserte proteinet til det periplasmatiske rommet hvor lederpeptidase spalter pelB-sekvensen. Det resulterende apoE4-NT-proteinet, uten sekvensmerker eller haler, unnslipper deretter bakteriene og akkumuleres i kulturmediet11,12, noe som forenkler nedstrømsbehandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

Begrepet nanodisk refererer til en diskret type nanopartikkel som består av et dobbeltlagsdannende lipid, et stillasprotein og et integrert bioaktivt middel. Nanodisker er organisert som et diskformet lipid-dobbeltlag hvis omkrets er omskrevet av stillasproteinet, vanligvis et medlem av den utskiftbare apolipoproteinfamilien. Tallrike hydrofobe bioaktive midler har blitt effektivt solubilisert i nanodisker ved deres integrering i det hydrofobe miljøet til partikkelens lipid-dobbeltlag, noe som gir en stort sett homogen populasjon av partikler i området 10-20 nm i diameter. Formuleringen av nanodisker krever et presist forhold mellom individuelle komponenter, en passende sekvensiell tilsetning av hver komponent, etterfulgt av badsonikering av formuleringsblandingen. Det amfipatiske stillasproteinet kontakter spontant og omorganiserer det dispergerte dobbeltlaget som danner lipid / bioaktiv middelblanding for å danne en diskret, homogen populasjon av nanodiskpartikler. Under denne prosessen går reaksjonsblandingen fra et ugjennomsiktig, uklart utseende til en klargjort prøve som, når den er fullt optimalisert, ikke gir noe utfelling ved sentrifugering. Karakteriseringsstudier involverer bestemmelse av bioaktiv agensoppløselighetseffektivitet, elektronmikroskopi, gelfiltreringskromatografi, ultrafiolett synlig (UV / Vis) absorbansspektroskopi og / eller fluorescensspektroskopi. Dette følges normalt av en undersøkelse av biologisk aktivitet ved hjelp av dyrkede celler eller mus. Når det gjelder nanodisker som har et antibiotika (dvs. makrolidpolyenantibiotikumet amfotericin B), kan deres evne til å hemme veksten av gjær eller sopp som en funksjon av konsentrasjon eller tid måles. Den relative enkle formuleringen, allsidigheten med hensyn til komponentdeler, nanoskala partikkelstørrelse, iboende stabilitet og vandig oppløselighet tillater myriade in vitro og in vivo applikasjoner av nanodiskteknologi. I denne artikkelen beskriver vi en generell metodikk for å formulere og karakterisere nanodisker som inneholder amfotericin B som det hydrofobe bioaktive middelet.

Bioaktivt middel nanodisk formuleringsprosess I den beskrevne ampB-nanodiskformuleringsprosedyren anses reaksjonen som fullført når prøveutseendet overgår fra uklart til klart (figur 1). Denne endringen indikerer at nanodisker har dannet seg og at det bioaktive stoffet har blitt solubilisert. Ofte absorberer bioaktive midler lys i det synlige bølgelengdeområdet (f.eks. ampB, curcumin, lutein, koenzym Q10), og i disse tilfellene vedtar prøven fargen på d...

Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Her beskriver vi produksjon og karakterisering av bioaktive stoffer som inneholder nanodisker. Amfotericin B nanodisker er tatt som et eksempel for å beskrive protokollen på en trinnvis måte.

Formulering og karakterisering av bioaktivt middel som inneholder nanodisker

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Denne protokollen gir praktisk kunnskap, nyttig for å formulere nanoskala partikler, dvs. nanodisker, som stabilt inneholder et bredt spekter av hydrofobe bioaktive molekyler. Denne metoden har mange praktiske anvendelser.Evnen til å gi vandig oppløselighet til ellers uoppløselige bioaktive forbindelser tillater bruk av nanodisker i legemiddelleveringsapplikasjoner. Metoden som beskrives er grei. Det er foretrukket å gjennomføre studier i den beskrevne skalaen, fem milligram fosfolipid, to milligram stillasprotein, slik at dannelsen av nanodisker lett overvåkes ved visuell inspeksjon.Demonstrere prosedyren vil være Michael Karo og Matthew Swackhammer, lavere student forskere i Ryan lab. For å forberede en fosfolipidalikot, veier du fem milligram DMPC og overfører den til et glassreagensrør. Oppløs fosfolipidet ved å tilsette 300 mikroliter kloroform og 100 mikroliter metanol i et forhold på tre til en.Fordamp det organiske løsningsmidlet ved å plassere glassreagensrøret under en mild strøm av nitrogengass i 10 til 15 minutter, slik at en tynn film av tørket fosfolipid dannes langs veggene i den nederste delen av røret. For å formulere amfotericin B eller AmpB-nanodisker, pipett 450 mikroliter PBS til lyofilisert fosfolipidalikot og virvel i 30 sekunder for å spre lipidet. Pipett 50 mikroliter på 20 milligram per milliliter lager AmpB-oppløsning i den dispergerte fosfolipidprøven og hvirvelen.Tilsett 500 mikroliter av fire milligram per milliliter ApoE4 NT stillasprotein til glassreagensrøret som inneholder det dispergerte fosfolipidet og AmpB. Bad sonicate prøven ved 24 grader Celsius til løsningen avklarer. For AmpB-Nanodisk dialyse, forberede en del av dialyseslangen ved grundig suge den i destillert avionisert vann i 10 minutter.Bruk en dialyseslangeklemme, klem den ene enden av den gjennomvåte dialyseslangen, slik at ingen væske kan slippe ut. Sett inn en smal nakketrakt i den åpne enden av dialyseslangen og overfør AmpB-Nanodisk-prøven inn i dialyseslangen. Fjern trakten, og klem enden av dialyseslangen med en annen dialyseslangeklemme.Plasser en skumdialysefloat på en av de forseglede endene av dialyseslangen, og plasser den monterte dialyseslangen i begeret som inneholder nylaget en liter PBS-buffer. Plasser en magnetisk rørestang i bunnen av begeret og juster omrøringskontrollen til lav, slik at den ikke produserer en virvel. Tillat dialyse å fortsette over natten ved fire grader Celsius.Slå på spektrofotometeret ved å vri strømbryteren og koble til en tilsvarende støttecomputer ved å trykke på PC-kontroll. På støttedatamaskinen åpner du programvaren merket UVProbe 2.61, og kobler til spektrofotometeret ved å klikke koble til "nederst i venstre hjørne. Klikk på spekteret, og klikk deretter metode"i den øverste verktøylinjen.Klikk på målingsfanen og skriv inn 500 i starttekstboksen som ligger under bølgelengdeområdet, og 300 i slutttekstboksen. Klikk på rullegardinmenyen ved siden av fanen merket skannehastighet "og sett den til middels. Forbered et prøveemne ved å overføre en milliliter DMSO til to kvartskuvetter.Legg begge kyvettene inn i de respektive prøveportene på spektrofotometeret. Klikk automatisk blank"og ta opp et spekter fra 300 til 500 nanometer ved å klikke start"nederst til venstre. For AmpB standard spektralanalyse, fjern kyvetten fra den fremre prøveporten og tilsett 20 mikroliter av en milligram per milliliter AmpB-lagerløsning.Legg kyvetten tilbake i prøvebrettet og klikk start "for å registrere prøveabsorbansen. Etter registrering av prøveabsorbans, fjern kyvetten og dekanter væskeinnholdet i en avfallsbeholder. Skyll kyvetten grundig med tre vasker avionisert vann, etterfulgt av tre vasker med 70% etanol.For spektralanalyse av forstyrret AmpB-Nanodisk, klargjør prøven ved å pipetere 20 mikroliter av ett milligram per milliliter AmpB-Nanodisk-lager i en milliliter DMSO, og inkubere i ett minutt før du registrerer spekteret. Sett kyvetten inn i den fremre prøvetakingsporten og klikk start "for å registrere prøveabsorbansen. For spektralanalyse av et PBS-bufferemne, lag et tomt ved å overføre en milliliter PBS til to kvartskuvetter.Legg kyvettene i prøveporten. Klikk automatisk blank"og registrer spekteret fra 300 til 500 nanometer. For spektralanalyse av en ikke-forstyrret AmpB-Nanodisk-prøve, fjern kyvetten fra den fremre prøveporten og tilsett 20 mikroliter av en en milligram per milliliter AmpB-Nanodisk-prøve i PBS-bufferen.Legg kyvetten tilbake i prøvebrettet. Klikk start"og registrer prøvespekteret. AmpB-Nanodisk-formuleringsreaksjonen anses som fullført når prøveutseendet overgår fra uklart til klart.UV-synlig absorpsjonsspektroskopi av AmpB-prøver i DMSO og PBS er vist. I DMSO ble det observert tre karakteristiske absorbansmaksima ved 372, 392 og 415 nanometer, topper som indikerer AmpB. Absorbansspektrene til AmpB-nanodisker i PBS viste en enkelt stor absorbanstopp ved en kortere bølgelengde.Til sammenligning virket absorbansspektrene til AmpB-nanodisker i DMSO lik spektrene til lager AmpB. Biologisk aktivitet av AmpB-nanodisker ble utført ved å vurdere gjærveksthemmingsanalyser. Kontrollprøver som PBS, DMSO og rekonstituerte lipoproteiner med høy tetthet viste at andre nanodiskkomponenter enn AmpB ikke har noen merkbar effekt på gjærvekst.Den positive kontrollen bekreftet at AmpB er en effektiv hemmer av gjærvekst. I tilfelle av AmpB-nanodisker ble konsentrasjonsavhengig veksthemmingsaktivitet observert. Ikke alle nanodiskpreparater er de samme.Noen kan kreve mer tid, forskjellige lipider eller forskjellige stillasproteiner. De eneste indistinct}er avklaring av nanodisk prøven. Denne teknikken har ført til nye nanopartikler som brukes til å studere doksorubicin-indusert kardiotoksisitet, apoptose, ligandinteraksjoner, og leverte mange vandige uoppløselige bioaktive molekyler, inkludert lutein og curcumin.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinere våte og tørre lab teknikker for å lede Krystallisering av Store Coiled-spiral inneholder proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturelle karakteristikk av Mannan cellevegg polysakkarider i planter ved hjelp av TEMPO

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Samtidig måling av Superoxide/Hydrogen Peroxide og NADH produksjon av Flavin inneholder mitokondrie Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Funksjonell karakteristikk av Carboxylesterases i insektmiddel resistente hus fluer, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt selvstendig karakterisering og datainnsamling fra krystaller av biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Bruk av Alu Element som inneholder minigenes å analysere sirkulære RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i E. coli og produksjon av membran blemmer

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...