Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения (R37 HL-64159).

1. Трансформация, экспрессия и очистка белкового компонента каркаса
<ol><li>Бактериальная трансформация BL21 с помощью плазмиды, содержащей apoE4-NT<ol><li>Разморозьте пробирку с компетентными ячейками BL21 (DE3) на льду в течение 10 мин.</li>
		<li>Как только весь лед растает, аккуратно и осторожн...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

Рецептура биологически активного агента, содержащего нанодиски, обеспечивает удобный метод растворения нерастворимых гидрофобных соединений. Поскольку нанодиски биологически активного агента продукта полностью растворимы в водных средах, они обеспечивают полезный способ доставки...

Зарождающиеся дискоидальные липопротеины высокой плотности (ЛПВП) являются естественными предшественниками гораздо более распространенных сферических ЛПВП, присутствующих в системе кровообращения человека. Эти зарождающиеся частицы, также называемые пре-ß ЛПВП, обладают уникальными и отличительными структурными свойствами1. Действительно, вместо того, чтобы существовать как сфероидальная частица, зарождающиеся ЛПВП имеют форму диска. Обширные исследования структурных характеристик естественных и восстановленных дискоидальных ЛПВП показали, что они состоят из фосфолипидного бислоя, периметр которого ограничен амфипатическим обменным аполипопротеином (апо), таким как апоА-I. В метаболизме липопротеинов человека циркулирующие зарождающиеся ЛПВП накапливают липиды из периферических клеток и созревают в сферические ЛПВП в процессе, который зависит от ключевых белковых медиаторов, включая кассетный транспортер A1, связывающий АТФ, и лецитин: холестерин ацилтрансферс2. Этот процесс представляет собой важнейший компонент обратного пути транспорта холестерина, который считается защитным от сердечных заболеваний. Вооружившись этими знаниями и способностью восстанавливать дискоидальные ЛПВП, исследователи использовали эти частицы в качестве терапевтического вмешательства для лечения атеросклероза3. По сути, вливание восстановленного ЛПВП (рЛПВП) пациентам способствует оттоку холестерина из отложений бляшек и возвращает его в печень для превращения в желчные кислоты и выведения из организма. Несколько биотехнологических/фармацевтических компаний придерживаются этой стратегии лечения4.
В то же время способность генерировать эти частицы в лаборатории вызвала шквал исследовательской деятельности, которая привела к новым приложениям и новым технологиям. Одно из известных применений включает использование частиц рЛПВП в качестве миниатюрной мембраны для размещения трансмембранных белков в нативной среде5. На сегодняшний день сотни белков были успешно включены в дискоидальный рЛПВП, и исследования показали, что эти белки сохраняют как нативную конформацию, так и биологическую активность в качестве рецепторов, ферментов, транспортеров и т. д. Также было показано, что эти частицы, называемые «нанодисками», поддаются структурной характеристике, часто с высоким разрешением6. Этот подход к исследованиям трансмембранных белков признан превосходящим исследования с моющими мицеллами или липосомами и, как следствие, быстро развивается. Важно признать, что сообщалось о двух различных методах, способных формировать рЛПВП. Метод «холатного диализа»13 популярен для применений, связанных с включением трансмембранных белков в бислой5 рЛПВП. По существу, этот способ приготовления включает смешивание двухслойного фосфолипида, белка каркаса и трансмембранного белка, представляющего интерес, в буфере, содержащем детергент холат натрия (или дезоксихолат натрия; молекулярная масса мицеллы [MW] 4,200 Да). Моющее средство эффективно растворяет различные компоненты реакции, позволяя диализовать образец против буфера, в котором отсутствует моющее средство. На этапе диализа, когда моющее средство удаляется из образца, спонтанно образуется рЛПВП. Когда этот подход используется для захвата интересующего трансмембранного белка, частицы продукта были названы нанодисками5. Однако попытки использовать этот метод для включения низкомолекулярных гидрофобных биологически активных агентов (MW <1000 Da) были в значительной степени безуспешными. В отличие от трансмембранных белков, низкомолекулярные биологически активные агенты способны выходить из диализного мешка вместе с детергентом, что значительно снижает эффективность их включения в рЛПВП. Эта проблема была решена путем исключения моющих средств из рецептурной смеси14. Вместо этого компоненты добавляют в водный буфер последовательно, начиная с бислоя, образующего липид, образуя стабильный биологически активный агент, содержащий рЛПВП, называемый нанодиском. Другие использовали рЛПВП для включения и транспортировки агентов визуализации in vivo 7. Совсем недавно специализированные рЛПВП, состоящие из каркаса аполипопротеина и анионного глицерофосфолипида, кардиолипина, использовались в исследованиях связывания лигандов. Эти частицы обеспечивают платформу для исследований взаимодействия кардиолипина с различными водорастворимыми лигандами, включая кальций, цитохром с и противоопухолевый агент доксорубицин8.
Основное внимание в настоящем исследовании уделяется составлению рЛПВП, которые обладают стабильно включенным гидрофобным биологически активным агентом (т.е. нанодиском). Способность этих агентов интегрироваться в липидную среду дискоидальных частиц рЛПВП эффективно придает им растворимость в воде. Таким образом, нанодиски имеют потенциал для терапевтического применения in vivo . При разработке нанодисков требуются определенные условия инкубации/реакции для успешного включения дискретных гидрофобных биологически активных агентов в частицу продукта, и целью этого отчета является предоставление подробной практической информации, которая может быть использована в качестве основополагающего шаблона для создания новых частиц нанодисков для конкретных применений. Таким образом, в контексте данной рукописи термины «нанодиск» и «нанодиск» не являются взаимозаменяемыми. В то время как нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для содержания трансмембранного белка, встроенного в его липидный бислой5, термин нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для включения низкомолекулярных (< 1000 Да) гидрофобных биологически активных агентов, таких как амфотерицин В14.
Существует множество методов получения подходящих белков каркаса. Можно приобрести каркасные белки у производителей [например, apoA-I (SRP4693) или apoE4 (A3234)], однако стоимость может быть ограничивающим фактором. Предпочтительным подходом является экспрессия рекомбинантных белков каркаса в Escherichia coli. Опубликованы протоколы для человека apoA-I9, apoE410, а также белка гемолимфы насекомых аполипофорина-III11. Для целей экспериментов, описанных в настоящем описании, использовали рекомбинантный N-концевой (NT) домен человека apoE4 (аминокислоты 1-183). Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий apoE4-NT, была синтезирована и вставлена в вектор экспрессии pET-22b (+), непосредственно примыкающий к векторно-кодируемой лидерной последовательности pelB. Эта конструкция приводит к экспрессии белка слияния лидерной последовательности pelB - apoE4-NT. После синтеза белка бактериальная лидерная последовательность pelB направляет вновь синтезированный белок в периплазматическое пространство, где пептидаза-лидер расщепляет последовательность pelB. Полученный белок apoE4-NT без меток последовательности или хвостов впоследствии ускользает от бактерий и накапливается в питательной среде11,12, упрощая последующую обработку.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

Термин нанодиск относится к дискретному типу наночастицы, состоящей из двухслойного липида, белка каркаса и интегрированного биологически активного агента. Нанодиски организованы в виде дискообразного липидного бислоя, периметр которого ограничен каркасным белком, обычно входящим в семейство обменных аполипопротеинов. Многочисленные гидрофобные биологически активные агенты были эффективно растворены в нанодисках путем их интеграции в гидрофобную среду липидного бислоя частицы, в результате чего образовалась в значительной степени однородная популяция частиц в диапазоне диаметром 10-20 нм. Составление нанодисков требует точного соотношения отдельных компонентов, соответствующего последовательного добавления каждого компонента с последующим ультразвуком в ванне смеси состава. Амфипатический каркасный белок спонтанно контактирует и реорганизует дисперсный бислой, образуя смесь липидов и биологически активных веществ, образуя дискретную однородную популяцию частиц нанодиска. Во время этого процесса реакционная смесь переходит от непрозрачного, мутного вида к осветленному образцу, который при полной оптимизации не дает осадка при центрифугировании. Характеризирующие исследования включают определение эффективности солюбилизации биологически активных веществ, электронную микроскопию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафиолетовую видимую (УФ/Vis) спектроскопию поглощения и/или флуоресцентную спектроскопию. Обычно за этим следует исследование биологической активности с использованием культивируемых клеток или мышей. В случае нанодисков, содержащих антибиотик (т.е. макролидный полиеновый антибиотик амфотерицин В), их способность ингибировать рост дрожжей или грибков в зависимости от концентрации или времени может быть измерена. Относительная простота составления, универсальность по отношению к составным частям, наноразмерный размер частиц, присущая стабильность и растворимость в воде позволяют применять технологию нанодисков in vitro и in vivo . В настоящей статье мы описываем общую методологию формулирования и характеристики нанодисков, содержащих амфотерицин B, в качестве гидрофобного биологически активного агента.

Процесс создания нанодисков с биологически активными веществами В описанной процедуре приготовления ampB-нанодиска реакция считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному (рис. 1). Это изменение указывает на то, что образова...

Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Здесь мы описываем производство и характеристику биологически активных агентов, содержащих нанодиски. Нанодиски амфотерицина B взяты в качестве примера для поэтапного описания протокола.

Рецептура и характеристика биологически активного агента, содержащего нанодиски

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Этот протокол предоставляет практические знания, полезные для создания наноразмерных частиц, т.е. нанодисков, которые стабильно включают широкий спектр гидрофобных биологически активных молекул. Этот метод имеет множество практических применений.Способность придавать растворимость в воде нерастворимым биологически активным соединениям позволяет использовать нанодиски в приложениях для доставки лекарств. Описанный метод прост. Предпочтительно проводить исследования в описанном масштабе, пять миллиграммов фосфолипида, два миллиграмма каркасного белка, так что образование нанодисков легко контролируется визуальным осмотром.Продемонстрируют процедуру Майкл Каро и Мэтью Свакхаммер, студенты-исследователи в лаборатории Райана. Чтобы приготовить аликвоту фосфолипида, взвесьте пять миллиграммов DMPC и перенесите его в стеклянную пробирку. Растворите фосфолипид, добавив 300 микролитров хлороформа и 100 микролитров метанола в соотношении три к одному.Выпарить органический растворитель, поместив стеклянную пробирку под мягкую струю газообразного азота на 10-15 минут, так что вдоль стенок нижней части пробирки образуется тонкая пленка высушенного фосфолипида. Чтобы получить амфотерицин B или AmpB-нанодиски, нанесите пипеткой 450 микролитров PBS на лиофилизированный фосфолипид аликвоту и встряхните в течение 30 секунд, чтобы диспергировать липид. Пипеткой 50 микролитров по 20 миллиграммов на миллилитр наберите раствор AmpB в дисперсный образец фосфолипида и вихрит.Добавьте 500 микролитров четырех миллиграммов на миллилитр каркасного белка ApoE4 NT в стеклянную пробирку, содержащую дисперсный фосфолипид и AmpB. Ванну обрабатывают ультразвуком при температуре 24 градуса Цельсия до тех пор, пока раствор не осветится. Для диализа AmpB-Nanodisk подготовьте секцию диализной трубки, тщательно замочив ее в дистиллированной деионизированной воде на 10 минут.Используя зажим для диализной трубки, зажмите один конец пропитанной диализной трубки, чтобы жидкость не могла выйти. Вставьте воронку с узким горлышком в открытый конец диализной трубки и перенесите образец AmpB-Nanodisk в диализную трубку. Снимите воронку и зажмите конец диализной трубки другим зажимом для диализной трубки.Поместите поплавок для пенного диализа на один из герметичных концов диализной трубки и поместите собранную диализную трубку в стакан, содержащий свежеприготовленный буфер PBS объемом в один литр. Поместите магнитную мешалку в нижнюю часть стакана и установите регулятор перемешивания на низкий уровень, чтобы избежать вихря. Позвольте диализу продолжаться в течение ночи при четырех градусах Цельсия.Включите спектрофотометр, щелкнув выключателем питания, и подключитесь к соответствующему вспомогательному компьютеру, нажав кнопку управления ПК. На компьютере поддержки откройте программное обеспечение с надписью UVProbe 2.61 и подключитесь к спектрофотометру, нажав «подключиться» в левом нижнем углу. Нажмите на спектр, затем нажмите метод"на верхней панели инструментов.Нажмите на вкладку измерения и введите 500 в начальное текстовое поле, расположенное в разделе «Диапазон длин волн», и 300 в конец«текстовое поле». Щелкните раскрывающееся меню рядом с вкладкой с надписью «Скорость сканирования»и установите его на средний. Подготовьте заготовку образца, перелив один миллилитр ДМСО в две кварцевые кюветы.Загрузите обе кюветы в соответствующие отверстия спектрофотометра. Нажмите «Авто пусто» и запишите спектр от 300 до 500 нанометров, нажав «Пуск»в левом нижнем углу. Для стандартного спектрального анализа AmpB извлеките кювету из переднего отверстия для образца и добавьте 20 микролитров одного миллиграмма на миллилитр исходного раствора AmpB.Загрузите кювету обратно в доску для образцов и нажмите «Пуск», чтобы записать поглощение образца. После регистрации поглощения образца извлеките кювету и сцедите жидкое содержимое в контейнер для отходов. Тщательно промойте кювету тремя промывками деионизированной воды, а затем тремя промывками с 70% этанолом.Для спектрального анализа разрушенного AmpB-нанодиска подготовьте образец путем пипетирования 20 микролитров одного миллиграмма на миллилитр AmpB-нанодиска в один миллилитр ДМСО и инкубируйте в течение одной минуты перед записью спектра. Загрузите кювету в передний порт для образцов и нажмите «Пуск», чтобы записать поглощение образца. Для спектрального анализа заготовки буфера PBS подготовьте заготовку, перелив один миллилитр PBS в две кварцевые кюветы.Загрузите кюветы в порт для образцов. Нажмите «Авто пусто» и запишите спектр от 300 до 500 нанометров. Для спектрального анализа образца AmpB-Nanodisk без разрушений извлеките кювету из переднего порта образца и добавьте 20 микролитров образца AmpB-Nanodisk объемом один миллиграмм на миллилитр в буфер PBS.Загрузите кювету обратно в доску для образцов. Нажмите «Пуск» и запишите спектр выборки. Реакция приготовления AmpB-Nanodisk считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному.Показана спектроскопия УФ-видимого поглощения образцов AmpB в ДМСО и ПБС. В ДМСО наблюдались три отличительных максимума поглощения на 372, 392 и 415 нанометров, пики, указывающие на AmpB. Спектры поглощения AmpB-нанодисков в PBS показали один крупный пик поглощения на более короткой длине волны.Для сравнения, спектры поглощения AmpB-нанодисков в ДМСО оказались похожи на спектры стоковых AmpB. Биологическую активность AmpB-нанодисков проводили путем оценки анализа ингибирования роста дрожжей. Контрольные образцы, такие как PBS, DMSO и восстановленные липопротеины высокой плотности, продемонстрировали, что компоненты нанодисков, отличные от AmpB, не оказывают заметного влияния на рост дрожжей.Положительный контроль подтвердил, что AmpB является эффективным ингибитором роста дрожжей. В случае AmpB-нанодисков наблюдалась концентрация-зависимая активность ингибирования роста. Не все препараты нанодисков одинаковы.Некоторым может потребоваться больше времени, другие липиды или разные белки каркаса. Они лишь нечеткие} - это осветление образца нанодиска. Этот метод привел к созданию новых наночастиц, используемых для изучения кардиотоксичности, апоптоза, лигандных взаимодействий, вызванных доксорубицином, и доставил многочисленные водные нерастворимые биологически активные молекулы, включая лютеин и куркумин.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Одновременное измерение супероксид/водорода пероксида и НАДН производства флавинсодержащих митохондриальной дегидрогеназ

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Функциональная характеристика Carboxylesterases в стойкие инсектициды дома мух, Муха Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Использование элемента Alu, содержащего минигены, для анализа циркулярных РНК

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Характеристика Мембранных Транспортеров по гетерологусному выражению в кишечной палочке и производству Мембранных Весиклей

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...