Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
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Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R37 HL-64159).

1. Transformación, expresión y purificación del componente proteico del andamio
<ol><li>Transformación bacteriana BL21 con plásmido que contiene apoE4-NT<ol><li>Descongele un tubo de células competentes BL21 (DE3) en hielo durante 10 min.</li>
		<li>Una vez que todo el hielo se haya derretido, mezclar suave y cuidadosamente pipetear 50 μL de las células en un tubo de transformación sobre hielo.</li>
		<li>Añadir 5 μL que contengan 50 ng de ADN plásmido (para la secuencia, véase la ...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

La formulación de un agente bioactivo que contiene nanodiscos proporciona un método conveniente para solubilizar compuestos hidrófobos insolubles. Debido a que los nanodiscos de agentes bioactivos del producto son completamente solubles en medios acuosos, proporcionan un método de administración útil para una amplia gama de moléculas hidrófobas (Tabla 1). Estos incluyen moléculas pequeñas, drogas naturales y sintéticas, fitonutrientes, hormonas, etc. La estrategia de formulación generalmente ...

Las lipoproteínas discoidales de alta densidad (HDL) nacientes son progenitores naturales del HDL esférico mucho más abundante presente en el sistema circulatorio humano. Estas partículas nacientes, también denominadas pre-ß HDL, poseen propiedades estructurales únicas y distintivas1. De hecho, en lugar de existir como una partícula esferoidal, las HDL nacientes tienen forma de disco. Extensos estudios de caracterización estructural en HDL discoidales naturales y reconstituidas han revelado que están compuestas por una bicapa de fosfolípidos cuyo perímetro está circunscrito por una apolipoproteína anfipática intercambiable (apo), como apoA-I. En el metabolismo de las lipoproteínas humanas, las HDL nacientes circulantes acumulan lípidos de las células periféricas y maduran en HDL esféricas en un proceso que depende de mediadores de proteínas clave, incluido el transportador de casete de unión a ATP A1 y la lecitina: aciltransfersade colesterol 2. Este proceso representa un componente crítico de la vía de transporte inverso del colesterol que se considera protector contra las enfermedades del corazón. Armados con este conocimiento y la capacidad de reconstituir HDL discoidales, los investigadores han empleado estas partículas como una intervención terapéutica para tratar la aterosclerosis3. En esencia, la infusión de HDL reconstituido (rHDL) en pacientes promueve el flujo de colesterol de los depósitos de placa y lo devuelve al hígado para su conversión en ácidos biliares y excreción del cuerpo. Varias empresas biotecnológicas/farmacéuticas están aplicando esta estrategia de tratamiento4.
Al mismo tiempo, la capacidad de generar estas partículas en el laboratorio ha provocado una ráfaga de actividades de investigación que ha llevado a nuevas aplicaciones y nuevas tecnologías. Una aplicación destacada implica el uso de partículas de rHDL como una membrana en miniatura para albergar proteínas transmembrana en un ambiente nativo5. Hasta la fecha, cientos de proteínas se han incorporado con éxito en la rHDL discoidal, y la investigación ha demostrado que estas proteínas conservan tanto la conformación nativa como la actividad biológica como receptores, enzimas, transportadores, etc. Estas partículas, denominadas "nanodiscos", también han demostrado ser susceptibles de caracterización estructural, a menudo a alta resolución6. Este enfoque para las investigaciones de proteínas transmembrana se reconoce como superior a los estudios con micelas detergentes o liposomas y, como resultado, está avanzando rápidamente. Es importante reconocer que se han reportado dos métodos distintos que son capaces de formar una rHDL. El método de "diálisis de colato"13 es popular para aplicaciones relacionadas con la incorporación de proteínas transmembrana en la bicapa5 de rHDL. Esencialmente, este método de formulación implica mezclar una bicapa formando fosfolípido, una proteína de andamio y la proteína transmembrana de interés en un tampón que contiene el detergente colato de sodio (o desoxicolato de sodio; peso molecular de micela [MW] de 4.200 Da). El detergente solubiliza eficazmente los diferentes componentes de la reacción, permitiendo que la muestra se dialice contra el tampón que carece de detergente. Durante el paso de diálisis, a medida que se retira el detergente de la muestra, se forma espontáneamente una rHDL. Cuando este enfoque se utiliza para atrapar una proteína transmembrana de interés, las partículas del producto se han denominado nanodiscos5. Sin embargo, los intentos de utilizar este método para incorporar agentes bioactivos hidrófobos de moléculas pequeñas (MW <1.000 Da) han sido en gran medida infructuosos. A diferencia de las proteínas transmembrana, los agentes bioactivos de moléculas pequeñas pueden escapar de la bolsa de diálisis junto con el detergente, disminuyendo en gran medida su eficiencia de incorporación en las rHDL. Este problema se resolvió omitiendo detergentes de la mezcla de formulación14. En cambio, los componentes se agregan a un tampón acuoso secuencialmente, comenzando con la bicapa formando lípidos, formando un agente bioactivo estable que contiene rHDL, denominado nanodisco. Otros han utilizado la rHDL para la incorporación y transporte de agentes de imagen in vivo 7. Más recientemente, se han empleado en estudios de unión de ligandos rHDL especializados compuestos por un andamio de apolipoproteína y el glicerofosfolípido aniónico, cardiolipina. Estas partículas proporcionan una plataforma para estudios de la interacción de la cardiolipina con varios ligandos solubles en agua, incluyendo calcio, citocromo c y el agente anticancerígeno doxorrubicina8.
El presente estudio se centra en la formulación de rHDL que poseen un agente bioactivo hidrofóbico incorporado de manera estable (es decir, nanodisco). La capacidad de estos agentes para integrarse en el medio lipídico de las partículas discoidales de rHDL les confiere efectivamente solubilidad acuosa. Como tal, los nanodiscos tienen el potencial para aplicaciones terapéuticas in vivo . Al formular nanodiscos, se requieren condiciones específicas de incubación / reacción para incorporar con éxito agentes bioactivos hidrófobos discretos en la partícula del producto, y el objetivo de este informe es proporcionar información práctica detallada que pueda usarse como plantilla fundamental para crear nuevas partículas de nanodiscos para aplicaciones específicas. Por lo tanto, en el contexto de este manuscrito los términos nanodisco y nanodisco no son intercambiables. Mientras que nanodisco se refiere a un rHDL formulado para contener una proteína transmembrana incrustada en su bicapa lipídica5, el término nanodisco se refiere a un rHDL formulado para incorporar agentes bioactivos hidrófobos de bajo peso molecular (< 1.000 Da), como la anfotericina B14.
Una variedad de métodos están disponibles para la adquisición de proteínas de andamio adecuadas. Es posible comprar proteínas de andamio de fabricantes [por ejemplo, apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], sin embargo, el costo puede ser un factor limitante. Un enfoque preferido es expresar proteínas de andamio recombinantes en Escherichia coli. Se publican protocolos para la apoA-I9 humana, apoE410, así como para la proteína hemolinfática del insecto apolipoforina-III11. Para los experimentos descritos en la presente invención, se utilizó el dominio N-terminal (NT) apoE4 humano recombinante (aminoácidos 1-183). La secuencia de nucleótidos que codifica apoE4-NT humano se sintetizó y se insertó en un vector de expresión pET-22b (+) directamente adyacente a la secuencia líder pelB codificada por vectores. Esta construcción conduce a la expresión de una proteína de fusión pelB leader sequence-apoE4-NT. Después de la síntesis de proteínas, la secuencia líder bacteriana pelB dirige la proteína recién sintetizada al espacio periplásmico donde la peptidasa líder escinde la secuencia pelB. La proteína apoE4-NT resultante, sin etiquetas de secuencia ni colas, escapa posteriormente de las bacterias y se acumula en el medio de cultivo11,12, simplificando el procesamiento posterior.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

El término nanodisco se refiere a un tipo discreto de nanopartícula compuesta por un lípido formador de bicapa, una proteína de andamio y un agente bioactivo integrado. Los nanodiscos están organizados como una bicapa lipídica en forma de disco cuyo perímetro está circunscrito por la proteína del andamio, generalmente un miembro de la familia de apolipoproteínas intercambiables. Numerosos agentes bioactivos hidrófobos se han solubilizado eficientemente en nanodiscos mediante su integración en el medio hidrofóbico de la bicapa lipídica de la partícula, produciendo una población en gran medida homogénea de partículas en el rango de 10-20 nm de diámetro. La formulación de nanodiscos requiere una proporción precisa de componentes individuales, una adición secuencial apropiada de cada componente, seguida de la sonicación en baño de la mezcla de formulación. La proteína del andamio anfipático contacta y reorganiza espontáneamente la bicapa dispersa formando una mezcla de lípidos / agentes bioactivos para formar una población discreta y homogénea de partículas de nanodiscos. Durante este proceso, la mezcla de reacción pasa de una apariencia opaca y turbia a una muestra clarificada que, cuando está completamente optimizada, no produce precipitado tras la centrifugación. Los estudios de caracterización implican la determinación de la eficiencia de solubilización del agente bioactivo, microscopía electrónica, cromatografía de filtración en gel, espectroscopia de absorbancia ultravioleta visible (UV / Vis) y / o espectroscopia de fluorescencia. Esto normalmente es seguido por una investigación de la actividad biológica utilizando células cultivadas o ratones. En el caso de los nanodiscos que albergan un antibiótico (es decir, el antibiótico polieno macrólido anfotericina B), se puede medir su capacidad para inhibir el crecimiento de levaduras u hongos en función de la concentración o el tiempo. La relativa facilidad de formulación, versatilidad con respecto a las partes componentes, tamaño de partícula a nanoescala, estabilidad inherente y solubilidad acuosa permite innumerables aplicaciones in vitro e in vivo de la tecnología de nanodiscos. En el presente artículo, describimos una metodología general para formular y caracterizar nanodiscos que contienen anfotericina B como agente bioactivo hidrófobo.

Proceso de formulación de nanodiscos de agentes bioactivos En el procedimiento de formulación de nanodiscos ampB descrito, la reacción se considera completa cuando la apariencia de la muestra pasa de turbia a clara (Figura 1). Este cambio indica que se han formado nanodiscos y que el agente bioactivo ha sido solubilizado. A menudo, los agentes bioactivos absorben la luz en la región de longitud de onda visible (por ejemplo, ampB, curcumina, luteína, coenzima Q10...

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Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Aquí, describimos la producción y caracterización de agentes bioactivos que contienen nanodiscos. Los nanodiscos de anfotericina B se toman como ejemplo para describir el protocolo de manera gradual.

Formulación y caracterización de nanodiscos que contienen agentes bioactivos

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Este protocolo proporciona conocimientos prácticos, útiles para formular partículas a nanoescala, es decir, nanodiscos, que incorporan de manera estable una amplia gama de moléculas bioactivas hidrófobas. Este método tiene muchas aplicaciones prácticas.La capacidad de conferir solubilidad acuosa a compuestos bioactivos insolubles permite el uso de nanodiscos en aplicaciones de administración de fármacos. El método descrito es sencillo. Se prefiere realizar estudios a la escala descrita, cinco miligramos de fosfolípidos, dos miligramos de proteína de andamio, de modo que la formación de nanodiscos se controle fácilmente mediante inspección visual.Demostrando el procedimiento estarán Michael Karo y Matthew Swackhammer, estudiantes de pregrado investigadores en el laboratorio Ryan. Para preparar una alícuota de fosfolípidos, pese cinco miligramos de DMPC y transfiérala a un tubo de ensayo de vidrio. Disuelva el fosfolípido agregando 300 microlitros de cloroformo y 100 microlitros de metanol para una proporción de tres a uno.Evapore el disolvente orgánico colocando el tubo de ensayo de vidrio bajo una corriente suave de gas nitrógeno durante 10 a 15 minutos, de modo que se forme una película delgada de fosfolípido seco a lo largo de las paredes de la parte inferior del tubo. Para formular nanodiscos de anfotericina B o AmpB, pipetear 450 microlitros de PBS a la alícuota de fosfolípidos liofilizados, y vortex durante 30 segundos para dispersar el lípido. Pipetear 50 microlitros de 20 miligramos por mililitro de solución madre de AmpB en la muestra dispersa de fosfolípidos y vórtice.Agregue 500 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de proteína de andamio ApoE4 NT al tubo de ensayo de vidrio que contiene el fosfolípido disperso y AmpB. Bañe la muestra a 24 grados centígrados hasta que la solución se aclare. Para la diálisis de nanodiscos AmpB, prepare una sección del tubo de diálisis empapándolo bien en agua destilada desionizada durante 10 minutos.Usando una abrazadera de tubo de diálisis, sujete un extremo del tubo de diálisis empapado, asegurándose de que no pueda escapar ningún líquido. Inserte un embudo de cuello estrecho en el extremo abierto del tubo de diálisis y transfiera la muestra de AmpB-Nanodisk al tubo de diálisis. Retire el embudo y sujete el extremo del tubo de diálisis con otra pinza para tubo de diálisis.Coloque un flotador de diálisis de espuma en uno de los extremos sellados del tubo de diálisis y coloque el tubo de diálisis ensamblado en el vaso de precipitados que contiene tampón PBS de un litro recién preparado. Coloque una barra de agitación magnética en la parte inferior del vaso de precipitados y ajuste el control de agitación a bajo, asegurándose de no producir un vórtice. Permita que la diálisis continúe durante la noche a cuatro grados centígrados.Encienda el espectrofotómetro girando el interruptor de encendido y conéctese a una computadora de soporte correspondiente presionando control de PC. En la computadora de soporte, abra el software etiquetado UVProbe 2.61 y conéctese al espectrofotómetro haciendo clic en conectar" en la esquina inferior izquierda. Haga clic en el espectro, luego haga clic en método"en la barra de herramientas superior.Haga clic en la pestaña de medición e ingrese 500 en el cuadro de texto "inicio ubicado debajo del rango de longitud de onda, y 300 en el cuadro de texto final". Haga clic en el menú desplegable junto a la pestaña etiquetada velocidad de escaneo"y configúrelo en medio. Prepare una muestra en blanco transfiriendo un mililitro de DMSO en dos cubetas de cuarzo.Cargue ambas cubetas en los respectivos puertos de muestra del espectrofotómetro. Haga clic en "en blanco automático" y grabe un espectro de 300 a 500 nanómetros haciendo clic en inicio" en la esquina inferior izquierda. Para el análisis espectral estándar de AmpB, retire la cubeta del puerto de muestra frontal y agregue 20 microlitros de un miligramo por mililitro de solución madre de AmpB.Cargue la cubeta de nuevo en el tablero de muestra y haga clic en "inicio" para registrar la absorbancia de la muestra. Después de registrar la absorbancia de la muestra, retire la cubeta y decanta el contenido líquido en un contenedor de desechos. Enjuague bien la cubeta con tres lavados de agua desionizada, seguido de tres lavados con etanol al 70%.Para el análisis espectral del nanodisco AmpB interrumpido, prepare la muestra pipeteando 20 microlitros de un miligramo por mililitro de material de nanodisco AmpB en un mililitro de DMSO e incube durante un minuto antes de registrar el espectro. Cargue la cubeta en el puerto de muestra frontal y haga clic en "iniciar" para registrar la absorbancia de la muestra. Para el análisis espectral de un espacio en blanco de tampón PBS, prepare un espacio en blanco transfiriendo un mililitro de PBS a dos cubetas de cuarzo.Cargue las cubetas en el puerto de muestra. Haga clic en "en blanco automático" y registre el espectro de 300 a 500 nanómetros. Para el análisis espectral de una muestra de AmpB-Nanodisco no interrumpida, retire la cubeta del puerto de muestra frontal y agregue 20 microlitros de una muestra de AmpB-Nanodisco de un miligramo por mililitro en el búfer PBS.Cargue la cubeta de nuevo en el tablero de muestra. Haga clic en "inicio" y registre el espectro de muestra. La reacción de formulación de AmpB-Nanodisk se considera completa cuando la apariencia de la muestra pasa de turbia a clara.Se muestra la espectroscopia de absorción visible UV de muestras de AmpB en DMSO y PBS. En DMSO, se observaron tres máximos de absorbancia distintivos a 372, 392 y 415 nanómetros, picos indicativos de AmpB. Los espectros de absorbancia de los nanodiscos AmpB en PBS mostraron un único pico de absorbancia mayor en una longitud de onda más corta.En comparación, los espectros de absorbancia de AmpB-Nanodisks en DMSO parecían similares a los espectros de AmpB stock. La actividad biológica de los nanodiscos AmpB se realizó mediante la evaluación de ensayos de inhibición del crecimiento de levaduras. Las muestras de control como PBS, DMSO y lipoproteínas de alta densidad reconstituidas demostraron que los componentes de nanodiscos distintos de AmpB no tienen un efecto discernible sobre el crecimiento de la levadura.El control positivo confirmó que AmpB es un inhibidor eficiente del crecimiento de levadura. En el caso de los nanodiscos AmpB, se observó actividad de inhibición del crecimiento dependiente de la concentración. No todas las preparaciones de nanodiscos son iguales.Algunos pueden requerir más tiempo, diferentes lípidos o diferentes proteínas de andamio. Lo único indistinto es la aclaración de la muestra de nanodisco. Esta técnica ha dado lugar a nuevas nanopartículas utilizadas para estudiar la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina, la apoptosis, las interacciones de ligandos, y ha entregado numerosas moléculas bioactivas insolubles acuosas, incluyendo luteína y curcumina.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina

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