Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (R37 HL-64159).

1. Transformation, uttryck och rening av ställningsproteinkomponent
<ol><li>BL21 bakteriell transformation med apoE4-NT innehållande plasmid<ol><li>Tina en tub BL21 (DE3) kompetenta celler på is i 10 min.</li>
		<li>När all is har smält, blanda försiktigt och försiktigt 50 μL av cellerna i ett transformationsrör på is.</li>
		<li>Tillsätt 5 μL innehållande 50 ng plasmid-DNA (för sekvens, se kompletterande tabell 1) till cellblandningen. Vrid försiktigt röret fyra eller ...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

Formulering av ett bioaktivt medel innehållande nanodiskar ger en lämplig metod för att solubilisera annars olösliga hydrofoba föreningar. Eftersom produktens bioaktiva substansnanodisketter är fullt lösliga i vattenhaltiga medier ger de en användbar leveransmetod för ett brett spektrum av hydrofoba molekyler (tabell 1). Dessa inkluderar små molekyler, naturliga och syntetiska droger, fytonäringsämnen, hormoner etc. Formuleringsstrategin följer vanligtvis ett standardprotokoll som måste ta ...

Framväxande discoidala högdensitetslipoproteiner (HDL) är naturligt förekommande föregångare till den mycket rikligare sfäriska HDL som finns i det mänskliga cirkulationssystemet. Dessa framväxande partiklar, även kallade pre-ß HDL, har unika och distinkta strukturella egenskaper1. I själva verket, snarare än att existera som en sfäroidal partikel, är framväxande HDL skivformade. Omfattande strukturella karakteriseringsstudier på naturliga och rekonstituerade discoidala HDL har visat att de består av ett fosfolipid-dubbelskikt vars omkrets omges av ett amfipatiskt utbytbart apolipoprotein (apo), såsom apoA-I. I human lipoproteinmetabolism ackumulerar cirkulerande begynnande HDL lipider från perifera celler och mognar till sfäriska HDL i en process som är beroende av viktiga proteinmediatorer, inklusive ATP-bindande kassetttransportör A1 och lecitin: kolesterolacyltransferse2. Denna process representerar en kritisk komponent i den omvända kolesteroltransportvägen som anses vara skyddande mot hjärtsjukdomar. Beväpnad med denna kunskap och förmågan att rekonstruera discoidala HDL har forskare använt dessa partiklar som ett terapeutiskt ingrepp för att behandla åderförkalkning3. I huvudsak främjar infusionen av rekonstituerad HDL (rHDL) till patienter kolesterolutflöde från plackavlagringar och återför det till levern för omvandling till gallsyror och utsöndring från kroppen. Flera bioteknik- / läkemedelsföretag följer denna behandlingsstrategi4.
Samtidigt har förmågan att generera dessa partiklar i laboratoriet utlöst en uppsjö av forskningsaktiviteter som har lett till nya tillämpningar och ny teknik. En framträdande tillämpning innefattar användningen av rHDL-partiklar som ett miniatyrmembran för att hysa transmembranproteiner i en infödd miljö5. Hittills har hundratals proteiner framgångsrikt införlivats i discoidal rHDL, och forskning har visat att dessa proteiner behåller både naturlig konformation och biologisk aktivitet som receptorer, enzymer, transportörer etc. Dessa partiklar, kallade "nanodiscs", har också visat sig vara mottagliga för strukturell karakterisering, ofta vid hög upplösning6. Detta tillvägagångssätt för undersökningar av transmembranproteiner erkänns som överlägset studier med tvättmedelsmiceller eller liposomer och går därför snabbt framåt. Det är viktigt att inse att två distinkta metoder har rapporterats som kan bilda en rHDL. "Cholatdialys" -metoden13 är populär för applikationer relaterade till införlivandet av transmembranproteiner i rHDL-bilager5. I huvudsak innefattar denna formuleringsmetod blandning av ett dubbelskikt som bildar fosfolipid, ett ställningsprotein och det transmembranprotein som är av intresse i en buffert innehållande tvättmedlet natriumkolat (eller natriumdeoxikolat; micellmolekylvikt [MW] på 4 200 Da). Tvättmedlet löser effektivt upp de olika reaktionskomponenterna, vilket gör att provet kan dialyseras mot buffert som saknar tvättmedel. Under dialyssteget, när tvättmedlet avlägsnas från provet, bildas en rHDL spontant. När detta tillvägagångssätt används för att fånga ett transmembranprotein av intresse har produktpartiklarna kallats nanoskivor5. Försök att använda denna metod för att införliva småmolekylära hydrofoba bioaktiva medel (MW <1000 Da) har dock i stort sett misslyckats. Till skillnad från transmembranproteiner kan småmolekylära bioaktiva medel fly från dialyspåsen tillsammans med tvättmedlet, vilket kraftigt minskar deras inkorporeringseffektivitet i rHDL. Detta problem löstes genom att utelämna tvättmedel från formuleringsblandningen14. Istället tillsätts komponenterna till en vattenhaltig buffert sekventiellt, som börjar med att dubbelskiktet bildar lipid och bildar ett stabilt bioaktivt medel innehållande rHDL, kallad en nanodisk. Andra har använt rHDL för inkorporering och transport av in vivo-avbildningsmedel 7. På senare tid har specialiserad rHDL bestående av en apolipoproteinställning och den anjoniska glycerofosfolipiden, kardiolipin, använts i ligandbindningsstudier. Dessa partiklar utgör en plattform för studier av interaktionen mellan kardiolipin och olika vattenlösliga ligander, inklusive kalcium, cytokrom c och cancermedlet doxorubicin8.
Fokus för denna studie ligger på formuleringen av rHDL som har ett stabilt inkorporerat hydrofobt bioaktivt medel (dvs. nanodisk). Dessa medels förmåga att integreras i lipidmiljön hos discoidala rHDL-partiklar ger dem effektivt vattenlöslighet. Som sådan har nanodiskar potential för in vivo terapeutiska tillämpningar. Vid formulering av nanodiskar krävs specifika inkubations-/reaktionsbetingelser för att framgångsrikt införliva diskreta hydrofoba bioaktiva ämnen i produktpartikeln, och målet med denna rapport är att ge detaljerad praktisk information som kan användas som en grundläggande mall för att skapa nya nanodiskpartiklar för specifika tillämpningar. Således är termerna nanodisc och nanodisk inte utbytbara i samband med detta manuskript. Medan nanodisc avser en rHDL formulerad för att innehålla ett transmembranprotein inbäddat i dess lipid bilayer5, hänvisar termen nanodisk till en rHDL formulerad för att införliva hydrofoba bioaktiva medel med låg molekylvikt (< 1,000 Da), såsom amfotericin B14.
En mängd olika metoder finns tillgängliga för förvärv av lämpliga ställningsproteiner. Det är möjligt att köpa ställningsproteiner från tillverkare [t.ex. apoA-I (SRP4693) eller apoE4 (A3234)], men kostnaden kan vara en begränsande faktor. Ett föredraget tillvägagångssätt är att uttrycka rekombinanta ställningsproteiner i Escherichia coli. Protokoll publiceras för humant apoA-I9, apoE410, liksom insektshemolymfproteinet apolipophorin-III11. För de experiment som beskrivs här användes rekombinant human apoE4 N-terminal (NT) domän (aminosyror 1-183). Nukleotidsekvensen som kodar för humant apoE4-NT syntetiserades och infördes i en pET-22b (+) uttrycksvektor direkt intill den vektorkodade pelB-ledarsekvensen. Denna konstruktion leder till uttrycket av ett pelB-ledarsekvens-apoE4-NT-fusionsprotein. Efter proteinsyntesen leder den bakteriella pelB-ledarsekvensen det nyligen syntetiserade proteinet till det periplasmatiska utrymmet där ledarpeptidas klyver pelB-sekvensen. Det resulterande apoE4-NT-proteinet, utan sekvenstaggar eller svansar, flyr därefter från bakterierna och ackumuleras i odlingsmediet11,12, vilket förenklar nedströms bearbetning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

Termen nanodisk avser en diskret typ av nanopartikel som består av ett dubbelskikt som bildar lipid, ett ställningsprotein och ett integrerat bioaktivt medel. Nanodiskar är organiserade som ett skivformat lipid-dubbelskikt vars omkrets är begränsad av ställningsproteinet, vanligtvis en medlem av den utbytbara apolipoproteinfamiljen. Många hydrofoba bioaktiva medel har effektivt solubiliserats i nanodiskar genom deras integration i den hydrofoba miljön i partikelns lipid-dubbelskikt, vilket ger en i stort sett homogen population av partiklar i intervallet 10-20 nm i diameter. Formuleringen av nanodiskar kräver ett exakt förhållande mellan enskilda komponenter, en lämplig sekventiell tillsats av varje komponent, följt av bad ultraljudsbehandling av formuleringsblandningen. Det amfipatiska ställningsproteinet kommer spontant i kontakt med och omorganiserar det dispergerade dubbelskiktet som bildar en blandning av lipid / bioaktivt medel för att bilda en diskret, homogen population av nanodiskpartiklar. Under denna process övergår reaktionsblandningen från ett ogenomskinligt, grumligt utseende till ett klarat prov som, när det är helt optimerat, inte ger någon fällning vid centrifugering. Karakteriseringsstudier innefattar bestämning av bioaktivt medel solubiliseringseffektivitet, elektronmikroskopi, gelfiltreringskromatografi, ultraviolett synlig (UV / Vis) absorbansspektroskopi och / eller fluorescensspektroskopi. Detta följs normalt av en undersökning av biologisk aktivitet med hjälp av odlade celler eller möss. När det gäller nanodiskar som hyser ett antibiotikum (dvs makrolidpolyenantibiotikumet amfotericin B) kan deras förmåga att hämma tillväxten av jäst eller svampar som en funktion av koncentration eller tid mätas. Den relativa lättheten att formulera, mångsidighet med avseende på komponentdelar, partikelstorlek i nanoskala, inneboende stabilitet och vattenlöslighet möjliggör otaliga in vitro- och in vivo-tillämpningar av nanodiskteknik. I denna artikel beskriver vi en generell metod för att formulera och karakterisera nanodiskar innehållande amfotericin B som det hydrofoba bioaktiva medlet.

Formuleringsprocess för bioaktivt medel nanodisk I den beskrivna ampB-nanodiskformuleringsproceduren anses reaktionen vara fullständig när provets utseende övergår från grumligt till klart (figur 1). Denna förändring indikerar att nanodiskar har bildats och att det bioaktiva medlet har solubiliserats. Ofta absorberar bioaktiva medel ljus i det synliga våglängdsområdet (t.ex. ampB, curcumin, lutein, koenzym Q10) och i dessa fall antar provet färgen p...

Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Här beskriver vi produktion och karakterisering av bioaktiva ämnen innehållande nanodiskar. Amfotericin B nanodiskar tas som ett exempel för att beskriva protokollet stegvis.

Formulering och karakterisering av bioaktivt medel innehållande nanodisketter

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Detta protokoll ger praktisk kunskap, användbar för att formulera partiklar i nanoskala, dvs nanodiskar, som stabilt innehåller ett brett spektrum av hydrofoba bioaktiva molekyler. Denna metod har många praktiska tillämpningar.Förmågan att ge vattenlöslighet till annars olösliga bioaktiva föreningar möjliggör användning av nanodiskar i läkemedelsleveransapplikationer. Metoden som beskrivs är enkel. Det är att föredra att genomföra studier i den beskrivna skalan, fem milligram fosfolipid, två milligram ställningsprotein, så att bildandet av nanodiskar lätt övervakas genom visuell inspektion.Demonstrerar proceduren kommer att vara Michael Karo och Matthew Swackhammer, doktorandforskare i Ryan-labbet. För att förbereda en fosfolipidalikvot, väg fem milligram DMPC och överför den till ett glasprovrör. Lös fosfolipiden genom att tillsätta 300 mikroliter kloroform och 100 mikroliter metanol för ett förhållande av tre till en.Indunsta det organiska lösningsmedlet genom att placera glasprovröret under en mild ström av kvävgas i 10 till 15 minuter, så att en tunn film av torkad fosfolipid bildas längs väggarna i rörets nedre del. För att formulera amfotericin B eller AmpB-nanodiskar, pipettera 450 mikroliter PBS till den frystorkade fosfolipidalikvoten och virvel i 30 sekunder för att sprida lipiden. Pipettera 50 mikroliter 20 milligram per milliliter AmpB-lösning i det dispergerade fosfolipidprovet och virveln.Tillsätt 500 mikroliter fyra milligram per milliliter ApoE4 NT-ställningsprotein till glasprovröret innehållande dispergerad fosfolipid och AmpB. Bad sonikera provet vid 24 grader Celsius tills lösningen klarnar. För AmpB-Nanodisk-dialys, förbered en sektion av dialysslangen genom att blötlägga den noggrant i destillerat avjoniserat vatten i 10 minuter.Använd en dialysslangklämma och kläm fast ena änden av den blötlagda dialysslangen, så att ingen vätska kan komma ut. För in en smal nacktratt i den öppna änden av dialysslangen och överför AmpB-Nanodisk-provet till dialysslangen. Ta bort tratten och kläm fast änden av dialysslangen med en annan dialysrörklämma.Placera en skumdialysflottör på en av de förseglade ändarna av dialysslangen och placera den monterade dialysslangen i bägaren som innehåller nyberedd en liter PBS-buffert. Placera en magnetisk omrörningsstång i botten av bägaren och justera omrörningskontrollen till låg, så att den inte producerar en virvel. Låt dialysen fortsätta över natten vid fyra grader Celsius.Slå på spektrofotometern genom att vrida strömbrytaren och anslut till en motsvarande stöddator genom att trycka på PC-kontroll. På supportdatorn öppnar du programvaran märkt UVProbe 2.61 och ansluter till spektrofotometern genom att klicka på anslut"i det nedre vänstra hörnet. Klicka på spektrumet och klicka sedan på metod"i det övre verktygsfältet.Klicka på mätfliken och mata in 500 i starttextrutan under våglängdsområdet och 300 i sluttextrutan. Klicka på rullgardinsmenyn bredvid fliken märkt skanningshastighet"och ställ in den på medium. Förbered ett provämne genom att överföra en milliliter DMSO till två kvartskyvetter.Ladda båda kyvetter i respektive provportar på spektrofotometern. Klicka på auto blank"och spela in ett spektrum från 300 till 500 nanometer genom att klicka på start"i det nedre vänstra hörnet. För AmpB standard spektralanalys, ta bort kyvetten från den främre provporten och tillsätt 20 mikroliter av ett milligram per milliliter AmpB stamlösning.Lägg tillbaka kyvetten i provbrädan och klicka på start"för att registrera provabsorbansen. Efter registrering av provabsorbansen, ta bort kyvetten och dekantera vätskeinnehållet i en avfallsbehållare. Skölj kyvetten noggrant med tre tvättar avjoniserat vatten, följt av tre tvättar med 70% etanol.För spektralanalys av störd AmpB-nanodisk, bereda provet genom att pipettera 20 mikroliter av ett milligram per milliliter AmpB-nanodisklager till en milliliter DMSO och inkubera i en minut innan spektrumet registreras. Ladda kyvetten i den främre provporten och klicka på start"för att registrera provabsorbansen. För spektralanalys av ett PBS-buffertämne, förbered ett ämne genom att överföra en milliliter PBS till två kvartskyvetter.Ladda kyvetterna i provporten. Klicka på auto blank"och spela in spektrumet från 300 till 500 nanometer. För spektralanalys av ett icke-stört AmpB-nanodiskprov, ta bort kyvetten från den främre provporten och tillsätt 20 mikroliter av ett milligram per milliliter AmpB-nanodiskprov i PBS-bufferten.Lägg tillbaka kyvetten i provbrädan. Klicka på start"och spela in provspektrumet. AmpB-Nanodisk-formuleringsreaktionen anses vara fullständig när provets utseende övergår från grumligt till klart.UV-synlig absorptionsspektroskopi av AmpB-prover i DMSO och PBS visas. I DMSO observerades tre distinkta absorbansmaxima vid 372, 392 och 415 nanometer, toppar som indikerar AmpB. Absorbansspektra för AmpB-nanodiskar i PBS visade en enda större absorbanstopp vid en kortare våglängd.I jämförelse verkade absorbansspektra för AmpB-nanodiskar i DMSO likna spektra för lager AmpB. Biologisk aktivitet av AmpB-nanodiskar utfördes genom att bedöma jästtillväxthämningsanalyser. Kontrollprover som PBS, DMSO och rekonstituerade lipoproteiner med hög densitet visade att andra nanodiskkomponenter än AmpB inte har någon märkbar effekt på jästtillväxt.Den positiva kontrollen bekräftade att AmpB är en effektiv hämmare av jästtillväxt. För AmpB-nanodisketter observerades koncentrationsberoende tillväxthämningsaktivitet. Inte alla nanodiskpreparat är desamma.Vissa kan kräva mer tid, olika lipider eller olika ställningsproteiner. De är bara otydliga} är förtydligandet av nanodiskprovet. Denna teknik har lett till nya nanopartiklar som används för att studera Doxorubicin-inducerad kardiotoxicitet, apoptos, ligandinteraktioner och levererat många vattenhaltiga olösliga bioaktiva molekyler, inklusive lutein och curcumin.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinera våta och torra Lab Tekniker Guide kristallisation av stora coiled-coil proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturell karaktärisering av Mannan cellväggen polysackarider i anläggningar som använder takt

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Samtidig mätning av superoxid-och/eller väteperoxid och NADH produktion av Flavin-innehållande mitokondriell mellan östradiol och östron

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Funktionell karakterisering av Carboxylesterases i insektsmedel resistenta hus flugor, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt självständigt karakterisering och datainsamling från kristaller av biologiska makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Användning av Alu Element som innehåller Minigenes för att analysera cirkulära RNA

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...