Name: formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R37 HL-64159) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. İskele protein bileşeninin dönüşümü, ekspresyonu ve saflaştırılması
<ol><li>Plazmid içeren apoE4-NT ile BL21 bakteriyel transformasyonu<ol><li>BL21 (DE3) yetkin hücrelerden oluşan bir tüpü buz üzerinde 10 dakika boyunca çözün.</li>
		<li>Tüm buzlar eridikten sonra, 50 μL hücreyi buz üzerindeki bir dönüşüm tüpüne nazikçe ve dikkatlice karıştırın.</li>
		<li>Hücre karışımına 50 ng plazmid DNA'sı içeren 5 μL ekleyin (dizi için Ek Tablo 1'e ba...

<ol>
	<li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device.">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).</li><li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+maturation+and+remodelling.">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).</li><li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+serial+infusions+of+CER-001,+a+pre-&#946;+high-density+lipoprotein+mimetic,+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial:+a+randomized+clinical+trial.">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-&#946; high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li><li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-targeted+therapies:+progress,+failures+and+future.">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins.">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure &amp; Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li><li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A.">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704 (2022).</li><li>P&#233;rez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles.">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+cardiolipin+interactome.">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).</li><li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I.">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li><li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification.">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li><li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein.">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li><li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overexpression,+isotope+enrichment,+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E.">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+high-density+lipoproteins.">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks:+hydrophobic+drug+delivery+vehicles.">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li><li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B.">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li><li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans-retinoic+acid+nanodisks.">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li><li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+nanodisks:+formulation+and+characterization.">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin.">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li><li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway.">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li><li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles.">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li><li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells.">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).</li><li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage.">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).</li><li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma.">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).</li><li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation.">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065 (2014).</li><li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes.">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li><li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks.">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li><li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex.">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li><li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers.">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li><li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein.">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).</li><li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).</li><li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas.">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li><li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle.">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li><li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks.">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li><li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks:+Implications+for+apoptosis.">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).</li><li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin.">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).</li><li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction.">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).</li></ol>

Nanodiskler içeren bir biyoaktif maddenin formülasyonu, aksi takdirde çözünmeyen hidrofobik bileşikleri çözmek için uygun bir yöntem sağlar. Ürün biyoaktif ajan nanodiskleri sulu ortamda tamamen çözünür olduğundan, çok çeşitli hidrofobik moleküller için yararlı bir dağıtım yöntemi sağlarlar (Tablo 1). Bunlar arasında küçük moleküller, doğal ve sentetik ilaçlar, bitkisel besinler, hormonlar vb. Bulunur. Formülasyon stratejisi genellikle biyoaktif maddenin organik çöz...

Yeni ortaya çıkan diskoidal yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL'ler), insan dolaşım sisteminde bulunan çok daha bol küresel HDL'nin doğal olarak oluşan progenitörleridir. Pre-ß HDL olarak da adlandırılan bu yeni ortaya çıkan parçacıklar, benzersiz ve ayırt edici yapısal özelliklere sahiptir1. Aslında, küresel bir parçacık olarak var olmak yerine, yeni ortaya çıkan HDL'ler disk şeklindedir. Doğal ve yeniden yapılandırılmış diskoidal HDL'ler üzerine yapılan kapsamlı yapısal karakterizasyon çalışmaları, çevresi apoA-I gibi bir amfipatik değiştirilebilir apolipoprotein (apo) ile çevrelenmiş bir fosfolipid çift katmandan oluştuğunu ortaya koymuştur. İnsan lipoprotein metabolizmasında, dolaşımdaki yeni ortaya çıkan HDL'ler, periferik hücrelerden lipitler tahakkuk ettirir ve ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı A1 ve lesitin: kolesterol asiltransferse2 dahil olmak üzere anahtar protein aracılarına bağlı bir süreçte küresel HDL'lere olgunlaşır. Bu süreç, kalp hastalığına karşı koruyucu olduğu düşünülen ters kolesterol taşıma yolunun kritik bir bileşenini temsil eder. Bu bilgi ve diskoidal HDL'leri yeniden oluşturma yeteneği ile donanmış olan araştırmacılar, bu parçacıkları aterosklerozu tedavi etmek için terapötik bir müdahale olarak kullandılar3. Temel olarak, yeniden yapılandırılmış HDL'nin (rHDL) hastalara infüzyonu, plak birikintilerinden kolesterol efflüksünü teşvik eder ve safra asitlerine dönüşüm ve vücuttan atılım için karaciğere geri döndürür. Birçok biyoteknoloji/ilaç şirketi bu tedavi stratejisini izlemektedir4.
Aynı zamanda, bu parçacıkları laboratuvarda üretme yeteneği, yeni uygulamalara ve yeni teknolojilere yol açan bir araştırma faaliyetleri telaşını tetiklemiştir. Öne çıkan bir uygulama, rHDL parçacıklarının, transmembran proteinlerini doğal benzeri bir ortamda barındırmak için minyatür bir membran olarak kullanılmasını içerir5. Bugüne kadar, yüzlerce protein diskoidal rHDL'ye başarıyla dahil edilmiştir ve araştırmalar, bu proteinlerin reseptörler, enzimler, taşıyıcılar vb. Olarak hem doğal konformasyonu hem de biyolojik aktiviteyi koruduğunu göstermiştir. "Nanodiskler" olarak adlandırılan bu parçacıkların, genellikle yüksek çözünürlükte6'da yapısal karakterizasyona uygun olduğu gösterilmiştir. Transmembran proteinlerinin araştırılmasına yönelik bu yaklaşım, deterjan miselleri veya lipozomlarla yapılan çalışmalardan daha üstün olarak kabul edilmektedir ve sonuç olarak hızla ilerlemektedir. Bir rHDL oluşturabilen iki farklı yöntemin bildirildiğini bilmek önemlidir. "Kolat diyalizi" yöntemi13 , transmembran proteinlerinin rHDL çift katmanlı5'e dahil edilmesiyle ilgili uygulamalar için popülerdir. Temel olarak, bu formülasyon yöntemi, fosfolipit oluşturan bir çift katmanlı, bir iskele proteini ve ilgilenilen transmembran proteininin, deterjan sodyum kolatı (veya sodyum deoksikolat; misel moleküler ağırlığı [MW] 4.200 Da) içeren bir tamponda karıştırılmasını içerir. Deterjan, farklı reaksiyon bileşenlerini etkili bir şekilde çözündürür ve numunenin deterjan içermeyen tamponlara karşı diyalize edilmesine izin verir. Diyaliz adımı sırasında, deterjan numuneden çıkarılırken, kendiliğinden bir rHDL oluşur. Bu yaklaşım, ilgilenilen bir transmembran proteinini yakalamak için kullanıldığında, ürün parçacıkları nanodiskler5 olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte, küçük moleküllü hidrofobik biyoaktif ajanları (MW <1.000 Da) dahil etmek için bu yöntemi kullanma girişimleri büyük ölçüde başarısız olmuştur. Transmembran proteinlerinin aksine, küçük moleküllü biyoaktif ajanlar, deterjanla birlikte diyaliz torbasından kaçabilir, bu da rHDL'lere dahil edilme verimliliklerini büyük ölçüde azaltır. Bu sorun, deterjanların formülasyon karışımı14'ten çıkarılmasıyla çözüldü. Bunun yerine, bileşenler sulu bir tampona sırayla eklenir, lipit oluşturan çift katmandan başlayarak, nanodisk olarak adlandırılan rHDL içeren kararlı bir biyoaktif ajan oluşturur. Diğerleri, in vivo görüntüleme ajanlarının dahil edilmesi ve taşınması için rHDL'yi kullanmıştır7. Daha yakın zamanlarda, ligand bağlama çalışmalarında bir apolipoprotein iskelesi ve anyonik gliserofosfolipid, kardiyolipinden oluşan özel rHDL kullanılmıştır. Bu parçacıklar, kardiyolipinin kalsiyum, sitokrom c ve antikanser ajanı doksorubisin8 dahil olmak üzere suda çözünür çeşitli ligandlarla etkileşiminin incelenmesi için bir platform sağlar.
Bu çalışmanın odak noktası, istikrarlı bir şekilde dahil edilmiş hidrofobik biyoaktif ajana (yani nanodisk) sahip olan rHDL'nin formülasyonu üzerinedir. Bu ajanların diskoidal rHDL partiküllerinin lipit ortamına entegre olma yeteneği, onlara etkili bir şekilde sulu çözünürlük kazandırır. Bu nedenle, nanodiskler in vivo terapötik uygulamalar için potansiyele sahiptir. Nanodiskleri formüle ederken, ayrık hidrofobik biyoaktif ajanları ürün parçacığına başarılı bir şekilde dahil etmek için spesifik inkübasyon / reaksiyon koşulları gereklidir ve bu raporun amacı, belirli uygulamalar için yeni nanodisk parçacıkları oluşturmak için temel bir şablon olarak kullanılabilecek ayrıntılı pratik bilgiler sağlamaktır. Bu nedenle, bu makale bağlamında, nanodisk ve nanodisk terimleri birbirinin yerine kullanılamaz. Nanodisk, lipit çift katmanlı5'e gömülü bir transmembran proteini içerecek şekilde formüle edilmiş bir rHDL'yi ifade ederken, nanodisk terimi, amfoterisin B14 gibi düşük moleküler ağırlıklı (< 1.000 Da) hidrofobik biyoaktif ajanları içerecek şekilde formüle edilmiş bir rHDL'yi ifade eder.
Uygun iskele proteinlerinin elde edilmesi için çeşitli yöntemler mevcuttur. İskele proteinlerini üreticilerden [örneğin apoA-I (SRP4693) veya apoE4 (A3234)] satın almak mümkündür, ancak maliyet sınırlayıcı bir faktör olabilir. Tercih edilen bir yaklaşım, Escherichia coli'deki rekombinant iskele proteinlerini eksprese etmektir. İnsan apoA-I9, apoE410 ve böcek hemolenf proteini apolipophorin-III11 için protokoller yayınlanmıştır. Burada açıklanan deneylerin amacı doğrultusunda, rekombinant insan apoE4 N-terminal (NT) alanı (amino asitler 1-183) kullanılmıştır. İnsan apoE4-NT'yi kodlayan nükleotid dizisi sentezlendi ve vektör kodlu pelB lider dizisine doğrudan bitişik bir pET-22b (+) ekspresyon vektörüne yerleştirildi. Bu yapı bir pelB lider dizisi-apoE4-NT füzyon proteininin ekspresyonuna yol açar. Protein sentezini takiben, bakteriyel pelB lider dizisi, yeni sentezlenen proteini, lider peptidazın pelB dizisini parçaladığı periplazmik boşluğa yönlendirir. Ortaya çıkan apoE4-NT proteini, hiçbir dizi etiketi veya kuyruğu olmadan, daha sonra bakterilerden kaçar ve11,12 kültür ortamında birikerek aşağı akış işlemeyi basitleştirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11636</td>
			<td>ND Formulation &#38; Standard Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP17925</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoE4-NT Plasmid</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled Flask</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3140-0250</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G607-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Standard Prepartation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymyristoylphosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850345P</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Bellco Biotechnology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt Ag &#38; Co</td>
			<td>D51588</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass borosilicate tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad (Software)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Sonication Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ND Formulaton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Nitrogen module</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-18822</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0407-03</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J325-IM-2</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td>Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7755030</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM media</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>N7200-1000.0</td>
			<td>Expansion &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet-22B vector</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875718</td>
			<td>Transformation &#38; Expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>14385 928A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1344-0004</td>
			<td>Transformation, Expansion, &#38; Expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Buoys</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66430</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88243</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/POR Weighted Closures</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>132736</td>
			<td>Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu UV-1800</td>
			<td>220-92961-01</td>
			<td>spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVProbe 2.61 (Software)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectral Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9004-70-0</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST Manufacturing Inc</td>
			<td>DOA-P704-AA</td>
			<td>Expression &#38; Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>ND Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BY4741</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract-Peptone-Dextrose</td>
			<td>BD</td>
			<td>242820</td>
			<td>Yeast Viability Assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulation and characterization of bioactive agent containing nanodisks

Nanodisk terimi, çift katmanlı bir lipit, bir iskele proteini ve entegre bir biyoaktif ajandan oluşan ayrı bir nanopartikül tipini ifade eder. Nanodiskler, çevresi genellikle değiştirilebilir apolipoprotein ailesinin bir üyesi olan iskele proteini tarafından çevrelenen disk şeklinde bir lipit çift katmanı olarak düzenlenir. Çok sayıda hidrofobik biyoaktif ajan, parçacığın lipit çift katmanının hidrofobik ortamına entegrasyonlarıyla nanodisklerde verimli bir şekilde çözünür ve çapı 10-20 nm aralığında büyük ölçüde homojen bir parçacık popülasyonu elde edilir. Nanodisklerin formülasyonu, bireysel bileşenlerin kesin bir oranını, her bir bileşenin uygun bir sıralı ilavesini ve ardından formülasyon karışımının banyo sonikasyonunu gerektirir. Amfipatik iskele proteini, ayrık, homojen bir nanodisk parçacıkları popülasyonu oluşturmak için lipit / biyoaktif ajan karışımı oluşturan dağınık çift katmanlı ile kendiliğinden temas eder ve yeniden düzenler. Bu proses sırasında, reaksiyon karışımı opak, bulanık bir görünümden, tamamen optimize edildiğinde santrifüjleme sırasında çökelti vermeyen berraklaştırılmış bir numuneye geçer. Karakterizasyon çalışmaları, biyoaktif madde çözünürlük verimliliği, elektron mikroskobu, jel filtrasyon kromatografisi, ultraviyole görünür (UV / Vis) absorbans spektroskopisi ve / veya floresan spektroskopisinin belirlenmesini içerir. Bunu normalde kültürlenmiş hücreler veya fareler kullanılarak biyolojik aktivitenin araştırılması izler. Bir antibiyotik barındıran nanodiskler (yani, makrolid polien antibiyotik amfoterisin B) durumunda, maya veya mantarların büyümesini konsantrasyon veya zamanın bir fonksiyonu olarak inhibe etme yetenekleri ölçülebilir. Formülasyonun göreceli kolaylığı, bileşen parçalarına göre çok yönlülük, nano ölçekli parçacık boyutu, doğal stabilite ve sulu çözünürlük, nanodisk teknolojisinin sayısız in vitro ve in vivo uygulamasına izin verir. Bu makalede, hidrofobik biyoaktif ajan olarak amfoterisin B içeren nanodiskleri formüle etmek ve karakterize etmek için genel bir metodoloji açıklanmaktadır.

Biyoaktif ajan nanodisk formülasyon prosesi Tarif edilen ampB-nanodisk formülasyon prosedüründe, numune görünümü bulanıktan berraklığa geçtiğinde reaksiyon tamamlanmış sayılır (Şekil 1). Bu değişiklik, nanodisklerin oluştuğunu ve biyoaktif maddenin çözünür hale geldiğini gösterir. Çoğu zaman, biyoaktif ajanlar görünür dalga boyu bölgesindeki ışığı emer (örneğin, ampB, kurkumin, lutein, koenzim Q10) ve bu durumlarda numun...

Watch this Scientific Journal Video about Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks at JoVE.com

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Burada, nanodiskler içeren biyoaktif ajanların üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Amfoterisin B nanodiskleri, protokolü aşamalı olarak tanımlamak için örnek olarak alınmıştır.

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Bu protokol, çok çeşitli hidrofobik biyoaktif molekülleri istikrarlı bir şekilde içeren nanoölçekli parçacıkları, yani nanodiskleri formüle etmek için yararlı olan pratik bilgi sağlar. Bu yöntemin birçok pratik uygulaması vardır.Aksi takdirde çözünmeyen biyoaktif bileşiklere sulu çözünürlük sağlama yeteneği, ilaç dağıtım uygulamalarında nanodisklerin kullanılmasına izin verir. Açıklanan yöntem basittir. Tarif edilen ölçekte, beş miligram fosfolipit, iki miligram iskele proteini üzerinde çalışmalar yapılması tercih edilir, böylece nanodisklerin oluşumu görsel inceleme ile kolayca izlenir.Prosedürü gösterenler, Ryan laboratuvarındaki lisans öğrencisi araştırmacılar Michael Karo ve Matthew Swackhammer olacak. Bir fosfolipid alikotu hazırlamak için, beş miligram DMPC'yi tartın ve bir cam test tüpüne aktarın. Fosfolipidi, üç ila bir oranında 300 mikrolitre kloroform ve 100 mikrolitre metanol ekleyerek çözün.Cam test tüpünü 10 ila 15 dakika boyunca yumuşak bir azot gazı akışının altına yerleştirerek organik çözücüyü buharlaştırın, böylece tüpün alt kısmının duvarları boyunca ince bir kurutulmuş fosfolipit filmi oluşur. Amfoterisin B veya AmpB-Nanodiskleri formüle etmek için, liyofilize fosfolipid aliquot'a 450 mikrolitre PBS pipet ve lipiti dağıtmak için 30 saniye boyunca vorteks yapın. Pipet, 50 mikrolitre stok başına 20 miligramlık AmpB çözeltisini dispersiyon fosfolipid numunesine ve vortekse solüfer.Dağılmış fosfolipid ve AmpB'yi içeren cam test tüpüne mililitre başına 500 mikrolitre dört miligram ApoE4 NT iskele proteini ekleyin. Banyo, çözelti netleşene kadar numuneyi 24 santigrat derecede sonikleştirin. AmpB-Nanodisk diyalizi için, 10 dakika boyunca damıtılmış deiyonize suya iyice batırarak diyaliz tüpünün bir bölümünü hazırlayın.Bir diyaliz tüpü kelepçesi kullanarak, ıslatılmış diyaliz tüpünün bir ucunu kelepçeleyerek sıvının kaçamamasını sağlayın. Diyaliz tüpünün açık ucuna dar bir boyun hunisi yerleştirin ve AmpB-Nanodisk örneğini diyaliz tüpüne aktarın. Huni çıkarın ve diyaliz tüpünün ucunu başka bir diyaliz tüpü kelepçesi ile sıkıştırın.Diyaliz tüpünün kapalı uçlarından birine bir köpük diyaliz şamandırası yerleştirin ve monte edilmiş diyaliz tüpünü taze hazırlanmış bir litrelik PBS tamponu içeren beherin içine yerleştirin. Beherin altına manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karıştırma kontrolünü düşük seviyeye ayarlayarak bir girdap üretmemesini sağlayın. Diyalizin gece boyunca dört santigrat derecede devam etmesine izin verin.Güç düğmesini çevirerek spektrofotometreyi açın ve PC kontrolüne basarak ilgili bir destek bilgisayarına bağlanın. Destek bilgisayarında, UVProbe 2.61 etiketli yazılımı açın ve sol alt köşedeki bağlan" düğmesine tıklayarak spektrofotometreye bağlanın. Spektruma tıklayın, ardından üst araç çubuğundaki yönteme tıklayın.Ölçüm sekmesine tıklayın ve dalga boyu aralığı altında bulunan başlangıç metin kutusuna 500 ve son" metin kutusuna 300 girin. "Tarama hızı" etiketli sekmenin yanındaki açılır menüyü tıklayın ve orta olarak ayarlayın. Bir mililitre DMSO'yu iki kuvars küvete aktararak boş bir numune hazırlayın.Her iki küveti de spektrofotometrenin ilgili numune portlarına yükleyin. Otomatik boşluğa tıklayın ve sol alt köşedeki başlat'a tıklayarak 300 ila 500 nanometre arasında bir spektrum kaydedin. AmpB standart spektral analizi için, küveti ön numune portundan çıkarın ve mililitre AmpB stok çözeltisi başına 20 mikrolitre bir miligram ekleyin.Küveti numune panosuna geri yükleyin ve numune emilimini kaydetmek için başlat düğmesine tıklayın. Numune emilimini kaydettikten sonra, küveti çıkarın ve sıvı içeriğini bir atık kabına boşaltın. Küveti üç yıkama deiyonize su ile iyice durulayın, ardından% 70 etanol ile üç yıkama yapın.Bozulmuş AmpB-Nanodisk'in spektral analizi için, mililitre başına bir miligramın 20 mikrolitresini bir mililitre DMSO'ya pipetleyerek numuneyi hazırlayın ve spektrumu kaydetmeden önce bir dakika boyunca inkübe edin. Küveti ön numune portuna yükleyin ve numune emilimini kaydetmek için "başlat" ı tıklayın. Bir PBS tampon boşluğunun spektral analizi için, bir mililitre PBS'yi iki kuvars küvete aktararak bir boşluk hazırlayın.Küvetleri numune portuna yükleyin. Otomatik boşluğa tıklayın "ve spektrumu 300 ila 500 nanometre arasında kaydedin. Bozulmamış bir AmpB-Nanodisk numunesinin spektral analizi için, küveti ön numune portundan çıkarın ve PBS tamponuna mililitre başına bir miligramın 20 mikrolitresini ekleyin.Küveti numune panosuna geri yükleyin. Başlat"a tıklayın ve örnek spektrumu kaydedin. AmpB-Nanodisk formülasyon reaksiyonu, numune görünümü bulanıktan berraklığa geçtiğinde tamamlanmış sayılır.DMSO ve PBS'deki AmpB örneklerinin UV görünür absorpsiyon spektroskopisi gösterilmiştir. DMSO'da, 372, 392 ve 415 nanometrelerde üç ayırt edici absorbans maksimumu, AmpB'nin göstergesi olan zirveler gözlendi. PBS'deki AmpB-Nanodisklerin absorbans spektrumları, daha kısa bir dalga boyunda tek bir büyük absorbans zirvesi gösterdi.Buna karşılık, DMSO'daki AmpB-Nanodisklerin absorbans spektrumları, stok AmpB'nin spektrumlarına benzer görünüyordu. AmpB-Nanodisklerin biyolojik aktivitesi, maya büyüme inhibisyon testleri değerlendirilerek gerçekleştirildi. PBS, DMSO ve yeniden yapılandırılmış yüksek yoğunluklu lipoproteinler gibi kontrol örnekleri, AmpB dışındaki nanodisk bileşenlerinin maya büyümesi üzerinde fark edilebilir bir etkisi olmadığını göstermiştir.Pozitif kontrol, AmpB'nin maya büyümesinin etkili bir inhibitörü olduğunu doğruladı. AmpB-Nanodiskler durumunda, konsantrasyona bağlı büyüme inhibisyonu aktivitesi gözlenmiştir. Tüm nanodisk preparatları aynı değildir.Bazıları daha fazla zaman, farklı lipitler veya farklı iskele proteinleri gerektirebilir. Onlar sadece belirsiz} nanodisk örneğinin açıklığa kavuşturulmasıdır. Bu teknik, Doksorubisin kaynaklı kardiyotoksisite, apoptoz, ligand etkileşimlerini incelemek için kullanılan yeni nanopartiküllere yol açmış ve lutein ve kurkumin dahil olmak üzere çok sayıda sulu çözünmez biyoaktif molekül sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...