Name: noninvasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice
Uploaded: 2023-03-31T13:40:00
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本研究は、中国国家自然科学基金会(第81903902号)、中国ポスドク科学基金会(第2019M663457号)、四川省科学技術プログラム(第2020年版)及び成都大学興林奨学生研究プレモーションプロジェクト(第QJRC2022053号)の支援を受けた。

動物実験プロトコルは、成都中医薬大学の管理委員会によってレビューおよび承認されました(記録番号2021-11)。雄のC57 / BLマウス(20〜25 g、6〜8週齢)を本研究に使用しました。マウスは動物室で飼育され、実験中は自由に飲んだり食べたりした。
1. 事前準備
<ol><li>挿管プラットフォームがベース、ライザー、ペーパークリップ、2つの輪ゴム、およびいくつか...

<ol>
	<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+human+amnion+epithelial+cells+through+endotracheal+instillation+against+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+mice.">Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice.</a> Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).</li><li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+A+clinical+and+molecular+review.">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li><li>Ware, L. B., Matthay, M. 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(52), e2581 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panaxydol+attenuates+ferroptosis+against+LPS-induced+acute+lung+injury+in+mice+by+Keap1-Nrf2/HO-1+pathway.">Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+epoxide+hydrolase+inhibitor+attenuates+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+and+improves+survival+in+mice.">Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice.</a> Shock. 47 (5), 638-645 (2017).</li><li>Nosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tube+length+of+orotracheal+intubation+for+mice.">Optimal tube length of orotracheal intubation for mice.</a> Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).</li><li>Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthesia+protocols+in+laboratory+animals+used+for+scientific+purposes.">Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes.</a> Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+acute+lung+injury+in+mice+by+direct+intratracheal+lipopolysaccharide+instillation.">Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT6+inhibits+ferroptosis+and+alleviates+acute+lung+injury+by+regulating+P53/SLC7A11+pathway.">STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 13 (6), 530 (2022).</li><li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+operational+tolerance+and+generation+of+regulatory+cells+after+intratracheal+delivery+of+alloantigen+combined+with+nondepleting+anti-CD4+monoclonal+antibody.">Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).</li><li>Lan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mammalian+target+of+rapamycin+(mTOR)+in+a+murine+model+of+lipopolysaccharide+(LPS)+-induced+acute+lung+injury+(ALI).">Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI).</a> Peking Union Medical College. , (2010).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenuigenin+ameliorates+acute+lung+injury+by+inhibiting+NF-&#954;B+and+MAPK+signalling+pathways.">Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-&#954;B and MAPK signalling pathways.</a> Respiratory Physiology &amp; Neurobiology. 216, 43-51 (2015).</li><li>Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oridonin+protects+LPS-induced+acute+lung+injury+by+modulating+Nrf2-mediated+oxidative+stress+and+Nrf2-independent+NLRP3+and+NF-&#954;B+pathways.">Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-&#954;B pathways.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).</li><li>Im, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+orthotopic+lung+cancer+mouse+model+via+thoracotomy+and+orotracheal+intubation+enabling+in+vivo+imaging+studies.">Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies.</a> Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).</li><li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation:+description,+evaluation+and+comparison+with+transillumination.">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).</li><li>Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+orotracheal+intubation+in+mice.">Repeated orotracheal intubation in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60844 (2020).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+packaging+IL-1&#946;+and+TNF-&#945;+enhance+lung+inflammatory+response+to+mechanical+ventilation+in+part+by+induction+of+cofilin+signaling.">Microvesicles packaging IL-1&#946; and TNF-&#945; enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling.</a> International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).</li><li>Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+different+intratracheal+instillation+in+acute+lung+injury+model+of+mice.">Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice.</a> Jilin University. , (2010).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acute+lung+injury+mice+model+established+by+intranasal+and+intratracheal+instillation+of+lipopolysaccharide.">Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).</li><li>Luckow, B., Lehmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+bronchoalveolar+lavage+in+mice+by+orotracheal+intubation+avoiding+tracheotomy.">A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy.</a> BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).</li></ol>

最初に、気管19の位置を見つけるために口腔内を調べました。しかし、この過程で、C57/BLマウスの気管が狭く、内視鏡20などの機器の助けを借りずにこの方法で正しい位置を見つけることが困難であることを発見しました。さらなる調査の結果、挿管器ランプからの光が体の表面を透過し、オペレータがカニューレ21の位置を決定すること?...

急性肺損傷(ALI)は一般的な臨床症候群です。さまざまな病原性因子の下で、肺上皮細胞および血管内皮細胞の生理学的障壁の破壊は、肺胞透過性の増加をもたらし、それによって肺コンプライアンスの低下、肺水腫、および重度の低酸素血症を引き起こします1。急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、ALIの最も重篤な形態です。制御されていない炎症と酸化ストレス損傷は、ALIとより重篤なARDSの主な原因であると考えられています2。外傷により肺胞上皮細胞が直接傷害を受けると、肺胞マクロファージの炎症反応連鎖が活性化し、肺に炎症が起こります3。世界的には、年間300万人以上の急性ARDS患者がおり、集中治療室の入院の約10%を占めています。さらに、重症例の死亡率は46%と高い4,5,6。したがって、その病因を研究するためにALIの適切な動物モデルを確立する必要がある。マウスは、その気道がALI研究のためにヒトの気道をうまくシミュレートできるため、ALIの研究で最も一般的に使用される実験動物です。さらに、ALIは、大量の炎症性細胞浸潤、肺血管透過性の増加、および肺水腫として現れます。血清中の炎症性サイトカインおよび肺乾燥湿潤重量比の変化は、ALI7の程度を反映する。
現在、マウスにおけるLPS誘発ALIをモデル化するための主な方法には、鼻腔内および外科的気管挿管が含まれます8,9。今回,非侵襲的中咽頭挿管によりLPSを気管内に送達する新しい手法を提案する.この方法は、照明付き挿管器を使用してマウスの気管を見つけ、LPSを気管と肺に送達します。この方法は、鼻腔内送達法よりも正確にLPSを肺に送達する。外科的気管挿管と比較して、この方法は手術を必要とせず、創傷を引き起こすことを回避し、マウスの痛みを軽減する10。したがって、この方法は、ALIのより説得力のあるマウスモデルを確立するために使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>MERK</td>
			<td>L4130</td>
			<td>LPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringes</td>
			<td>SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD</td>
			<td>10028505008124</td>
			<td>To deliver LPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cannula</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>803-03008-00</td>
			<td>Mouse cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse intubation kit</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>903-03027-00</td>
			<td>Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biosharp life science</td>
			<td>BS-XG-03</td>
			<td>To verify the success of intubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Beijing Chemical Co., China</td>
			<td>20220918</td>
			<td>To anesthetize mice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice

リポ多糖(LPS)またはエンドトキシンによって誘導される急性肺損傷(ALI)マウスモデルは、急性肺損傷または急性炎症の動物実験において依然として最も一般的に使用されているモデルの1つです。急性肺損傷マウスモデルにおいて現在最も一般的に使用されている方法は、LPSの腹腔内注射とLPSの気管注入のための気管切開である。しかし、前者の方法は肺の標的化を欠いて他の臓器に損傷を与え、後者の方法は手術外傷、感染リスク、および低い生存率を誘発します。ここでは,マウスへのLPS点滴に対する非侵襲的中咽頭気管内挿管法を推奨する.この方法では、LPSは、気管内挿管のための装置の助けを借りて肺に点滴される口腔咽頭腔を通して気管に非侵襲的に導入される。この方法は、肺の標的化を保証するだけでなく、動物の損傷や死亡のリスクを回避します。このアプローチは、急性肺障害の分野で広く使用されるようになることが期待されます。

LPS点眼後12時間における炎症性サイトカインTNF-αの発現と肺乾湿重量比を評価することにより,マウスにおけるLPS点滴の提案方法を検証した。実験には、ブランクコントロール(治療なし)、外科的挿管16、鼻腔内挿管17,18、および非侵襲的中咽頭挿管(n = 6)の4つのグループがありました。ブランク対照群と比較...

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Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

ここでは、非侵襲的中咽頭気管内挿管 を介した 気管内リポ多糖(LPS)送達のプロトコルを提案します。この方法は、動物の外科的処置の外傷を最小限に抑え、LPSを気管、次に肺に正確に送達します。

マウスにおける非侵襲的気管内リポ多糖点滴

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

私たちのプロトコルは、気管から肺へのLPSの新しい非侵襲的送達方法をより正確に提案します。この方法を初めて試す人は、気管の位置を見つけることに多くの努力を払う必要があります。挿管プラットフォームを準備するには、ひもを2つの穴に通し、その端をライザー上部の小さな突起に結び付けます。次に、クリップの両端に2本の輪ゴムを取り付け、ライザーの背面にテープで留めます。最後に、ライザーをベースに90度の角度で固定します。カニューレをカニューレペンに組み立て、ペンのライトをオンにします。次に、70%アルコールを使用して小型外科用鉗子とパスツールピペットを消毒します。試験化合物溶液を調製するには、1ミリリットルのpH 7.2 PBSに3ミリグラムのリポ多糖(LPS)を加えます。次に、10ミリグラムのペントバルビタールナトリウムを1ミリリットルの生理食塩水に溶解し、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。麻酔をかけたマウスを挿管プラットフォームに置きます。次に、上部の前歯をひもで固定し、2つの前足を輪ゴムで固定します。ピンセットを使用して、舌を引き抜いて保持します。カニューレを口に沿って下顎喉頭蓋までゆっくりと押します。カニューレペンのライトで気管の位置を確認し、ゆっくりとカニューレを挿入します。次に、挿管ペンを引き出し、カニューレを内側に残します。パスツールピペットをカニューレジョイントに挿入し、ヘッドを押します。気管内挿管が成功した後、フラットヘッドマイクロシリンジを使用して、調製したLPS溶液をカニューレを通してキログラムあたり3ミリグラムの用量で注入します。終了したら、マイクロシリンジとカニューレを取り出します。挿管プラットフォームからマウスを取り外し、別のケージに入れて回復します。マウスが回復して意識を取り戻すまで、マウスの呼吸状態を観察します。LPS気管点眼後12時間で、炎症性サイトカイン、TNF-α、および肺乾湿重量比の発現を評価し、他の点眼法と比較した。非侵襲的中咽頭挿管群の血清TNF-αレベルは、ブランク対照群と比較して有意に増加した。肺乾湿重量比も増加し、外科的気管挿管群と同じレベルに達した。気管の位置を見つける過程で気管を傷つけないことが重要です。この技術は、非侵襲的な方法で肺に到達する必要がある他の薬物を送達するためにも使用できます。

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