Name: noninvasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice
Uploaded: 2023-03-31T13:40:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.: 81903902), pela China Postdoctoral Science Foundation (No.: 2019M663457), pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (No.: 2020YJ0172) e pelo Xinglin Scholar Research Premotion Project da Universidade de Chengdu da TCM (No.: QJRC2022053).

O protocolo de experimentação animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Gestão da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Registro No. 2021-11). Camundongos C57/BL machos (20-25 g, 6-8 semanas de idade) foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram mantidos em uma câmara de animais e foram livres para beber e comer durante o experimento.
1. Preparo
<ol><li>Certifique-se de que a plataforma de intubação seja composta por uma base, u...

<ol>
	<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+human+amnion+epithelial+cells+through+endotracheal+instillation+against+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+mice.">Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice.</a> Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).</li><li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+A+clinical+and+molecular+review.">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li><li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).</li><li>Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+distress+syndrome:+Advances+in+diagnosis+and+treatment.">Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment.</a> JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).</li><li>Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. 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D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthesia+protocols+in+laboratory+animals+used+for+scientific+purposes.">Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes.</a> Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+acute+lung+injury+in+mice+by+direct+intratracheal+lipopolysaccharide+instillation.">Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT6+inhibits+ferroptosis+and+alleviates+acute+lung+injury+by+regulating+P53/SLC7A11+pathway.">STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 13 (6), 530 (2022).</li><li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+operational+tolerance+and+generation+of+regulatory+cells+after+intratracheal+delivery+of+alloantigen+combined+with+nondepleting+anti-CD4+monoclonal+antibody.">Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).</li><li>Lan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mammalian+target+of+rapamycin+(mTOR)+in+a+murine+model+of+lipopolysaccharide+(LPS)+-induced+acute+lung+injury+(ALI).">Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI).</a> Peking Union Medical College. , (2010).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenuigenin+ameliorates+acute+lung+injury+by+inhibiting+NF-&#954;B+and+MAPK+signalling+pathways.">Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-&#954;B and MAPK signalling pathways.</a> Respiratory Physiology &amp; Neurobiology. 216, 43-51 (2015).</li><li>Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oridonin+protects+LPS-induced+acute+lung+injury+by+modulating+Nrf2-mediated+oxidative+stress+and+Nrf2-independent+NLRP3+and+NF-&#954;B+pathways.">Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-&#954;B pathways.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).</li><li>Im, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+orthotopic+lung+cancer+mouse+model+via+thoracotomy+and+orotracheal+intubation+enabling+in+vivo+imaging+studies.">Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies.</a> Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).</li><li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation:+description,+evaluation+and+comparison+with+transillumination.">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).</li><li>Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+orotracheal+intubation+in+mice.">Repeated orotracheal intubation in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60844 (2020).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+packaging+IL-1&#946;+and+TNF-&#945;+enhance+lung+inflammatory+response+to+mechanical+ventilation+in+part+by+induction+of+cofilin+signaling.">Microvesicles packaging IL-1&#946; and TNF-&#945; enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling.</a> International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).</li><li>Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+different+intratracheal+instillation+in+acute+lung+injury+model+of+mice.">Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice.</a> Jilin University. , (2010).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acute+lung+injury+mice+model+established+by+intranasal+and+intratracheal+instillation+of+lipopolysaccharide.">Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).</li><li>Luckow, B., Lehmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+bronchoalveolar+lavage+in+mice+by+orotracheal+intubation+avoiding+tracheotomy.">A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy.</a> BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).</li></ol>

Inicialmente, foi realizada uma busca no interior da cavidade oral para encontrar a localização datraqueia19. No entanto, durante esse processo, descobrimos que a traqueia de camundongos C57/BL é estreita, o que dificulta encontrar a localização correta por esse método sem o auxílio de equipamentos como um endoscópio20. Após uma exploração mais aprofundada, verificou-se que a luz da lâmpada do intubador poderia penetrar na superfície do corpo, permitindo ao ope...

A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma síndrome clínica comum. Sob uma variedade de fatores patogênicos, a ruptura da barreira fisiológica das células epiteliais pulmonares e das células endoteliais vasculares leva ao aumento da permeabilidade alveolar, causando diminuição da complacência pulmonar, edema pulmonar e hipoxemia grave1. A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é a forma mais grave de LPA. A inflamação não controlada e os danos causados pelo estresse oxidativo são considerados as principais causas de LPA e de SDRA mais grave2. Quando as células epiteliais alveolares são diretamente lesadas devido ao trauma, a cadeia de resposta inflamatória dos macrófagos alveolares é ativada, levando à inflamação nopulmão3. Globalmente, há mais de 3 milhões de pacientes com SDRA aguda por ano, e eles respondem por aproximadamente 10% das admissões em unidades de terapia intensiva; Além disso, a taxa de mortalidade nos casos graves chega a 46%4,5,6. Portanto, há necessidade de se estabelecer um modelo animal adequado de LPA para estudar sua patogênese. O camundongo é o animal experimental mais comumente usado no estudo da LPA, uma vez que seu trato respiratório pode simular bem o trato respiratório humano para estudos de LPA. Além disso, a LPA manifesta-se como infiltrado maciço de células inflamatórias, aumento da permeabilidade vascular pulmonar e edema pulmonar. As alterações nas citocinas inflamatórias no soro e na relação peso seco-úmido do pulmão refletem o grau de LPA7.
Atualmente, os principais métodos para modelagem da LPA induzida por LPS em camundongos incluem a intubação traqueal intranasal e cirúrgica 8,9. Aqui, propomos um novo método para liberar LPS na traqueia via intubação orofaríngea não invasiva. Este método usa um intubador iluminado para encontrar a traqueia do rato e, em seguida, entrega LPS na traqueia e pulmão. Este método entrega LPS aos pulmões com mais precisão do que o método intranasal de entrega. Comparado à intubação traqueal cirúrgica, esse método não requer cirurgia, evita ferimentos e reduz a dor em camundongos10. Portanto, esse método pode ser usado para estabelecer um modelo de LPA em camundongos mais convincente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>MERK</td>
			<td>L4130</td>
			<td>LPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringes</td>
			<td>SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD</td>
			<td>10028505008124</td>
			<td>To deliver LPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cannula</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>803-03008-00</td>
			<td>Mouse cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse intubation kit</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>903-03027-00</td>
			<td>Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biosharp life science</td>
			<td>BS-XG-03</td>
			<td>To verify the success of intubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Beijing Chemical Co., China</td>
			<td>20220918</td>
			<td>To anesthetize mice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice

O modelo de lesão pulmonar aguda (LPA) em camundongos induzida por lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina ainda está entre os modelos mais comumente utilizados em estudos animais de lesão pulmonar aguda ou inflamação aguda. Os métodos atualmente mais utilizados em modelos de lesão pulmonar aguda em camundongos são a injeção intraperitoneal de LPS e a traqueostomia para a infusão traqueal de LPS. No entanto, o primeiro método não tem como alvo o pulmão e danifica outros órgãos, e o segundo método induz trauma operatório, risco de infecção e baixa taxa de sobrevida. Aqui, recomendamos um método não invasivo de intubação orofaríngea endotraqueal para instilação de LPS em camundongos. Nesse método, o LPS é introduzido de forma não invasiva na traqueia através da cavidade orofaríngea para ser instilado no pulmão com o auxílio de um aparelho para intubação endotraqueal. Este método não só garante a segmentação pulmonar, mas também evita danos e o risco de morte nos animais. Esperamos que essa abordagem se torne amplamente utilizada no campo da lesão pulmonar aguda.

O método proposto para instilação de LPS em camundongos foi verificado avaliando-se a expressão da citocina inflamatória TNF-α e a relação peso seco-úmido pulmonar 12 h após a instilação de LPS. Foram quatro grupos no experimento: controle em branco (sem tratamento), intubação cirúrgica16, intranasal17,18 e intubação orofaríngea não invasiva (n = 6). Em comparação com o grupo controle b...

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Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

Neste trabalho, propomos um protocolo para a administração intratraqueal de lipopolissacarídeo (LPS) via intubação endotraqueal orofaríngea não invasiva. Este método minimiza o trauma do procedimento cirúrgico para o animal e entrega com precisão LPS para a traqueia e, em seguida, para os pulmões.

Instilação não invasiva de lipopolissacarídeo intratraqueal em camundongos

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

Nosso protocolo propõe um novo método de liberação não invasiva de LPS da traqueia para o pulmão, com maior precisão. As pessoas que estão tentando este método pela primeira vez devem colocar muito esforço em encontrar a posição da traqueia. Para preparar a plataforma de intubação, passe a corda pelos dois orifícios e amarre suas extremidades às pequenas saliências no topo do riser.Em seguida, prenda dois elásticos em cada extremidade do clipe de papel e tape-os nas costas do riser. Finalmente, fixe o riser na base em um ângulo de 90 graus. Monte a cânula em uma caneta de cânula e acenda a luz da caneta.Em seguida, desinfete a pinça cirúrgica pequena e a pipeta de Pasteur com álcool a 70%. Para preparar a solução do composto de teste, adicione três miligramas de lipopolissacarídeo, ou LPS, em um mililitro de pH 7,2 PBS. Em seguida, dissolva 10 miligramas de pentobarbital sódico em um mililitro de soro fisiológico normal e filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,45 micrômetro.Coloque o mouse anestesiado na plataforma de intubação. Em seguida, fixe os dentes dianteiros superiores com a barbante e os dois antepés com os elásticos. Usando uma pinça, puxe a língua para fora e segure-a.Empurre a cânula lentamente ao longo da boca até a epiglote mandibular. Localize a traqueia com a luz da caneta da cânula e insira lentamente a cânula nela. Em seguida, retire a caneta de intubação, deixando a cânula dentro.Insira a pipeta Pasteur na junta da cânula e pressione o cabeçote. Após a intubação endotraqueal bem-sucedida, usando uma microseringa de cabeça plana, instilar a solução de LPS preparada a três miligramas por quilograma de dose através da cânula. Depois de terminar, retire a microseringa e a cânula.Remova o mouse da plataforma de intubação e coloque-o em uma gaiola separada para recuperar. Observe o estado respiratório do camundongo até que ele se recupere e recupere a consciência. 12 horas após a instilação traqueal do LPS, a expressão de uma citocina inflamatória, TNF-alfa, e a relação peso seco-úmido do pulmão foram avaliadas e comparadas com outros métodos de instilação.Os níveis séricos de TNF-alfa no grupo intubação orofaríngea não invasiva estavam significativamente aumentados em comparação com o grupo controle branco. A relação peso seco/úmido do pulmão também foi aumentada, atingindo o mesmo nível do grupo intubação traqueal cirúrgica. É importante não coçar a traqueia no processo de encontrar a localização da traqueia.A técnica também pode ser usada para liberar outras drogas que precisam chegar ao pulmão de forma não invasiva.

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