Name: noninvasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice
Uploaded: 2023-03-31T13:40:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.: 81903902), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.: 2019M663457), el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (No.: 2020YJ0172) y el Proyecto de Premoción de Investigación Académica Xinglin de la Universidad de Chengdu de TCM (No.: QJRC2022053).

El protocolo de experimentación con animales fue revisado y aprobado por el Comité de Gestión de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro No. 2021-11). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57/BL (20-25 g, 6-8 semanas de edad). Los ratones se mantuvieron en una cámara de animales y fueron libres de beber y comer durante el experimento.
1. Preparación
<ol><li>Asegúrese de que la plataforma de intubación consista en una base, un...

<ol>
	<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+human+amnion+epithelial+cells+through+endotracheal+instillation+against+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+mice.">Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice.</a> Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).</li><li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+A+clinical+and+molecular+review.">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li><li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).</li><li>Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+distress+syndrome:+Advances+in+diagnosis+and+treatment.">Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment.</a> JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).</li><li>Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. 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D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthesia+protocols+in+laboratory+animals+used+for+scientific+purposes.">Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes.</a> Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).</li><li>Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+acute+lung+injury+in+mice+by+direct+intratracheal+lipopolysaccharide+instillation.">Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT6+inhibits+ferroptosis+and+alleviates+acute+lung+injury+by+regulating+P53/SLC7A11+pathway.">STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 13 (6), 530 (2022).</li><li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+operational+tolerance+and+generation+of+regulatory+cells+after+intratracheal+delivery+of+alloantigen+combined+with+nondepleting+anti-CD4+monoclonal+antibody.">Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).</li><li>Lan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mammalian+target+of+rapamycin+(mTOR)+in+a+murine+model+of+lipopolysaccharide+(LPS)+-induced+acute+lung+injury+(ALI).">Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI).</a> Peking Union Medical College. , (2010).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenuigenin+ameliorates+acute+lung+injury+by+inhibiting+NF-&#954;B+and+MAPK+signalling+pathways.">Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-&#954;B and MAPK signalling pathways.</a> Respiratory Physiology &amp; Neurobiology. 216, 43-51 (2015).</li><li>Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oridonin+protects+LPS-induced+acute+lung+injury+by+modulating+Nrf2-mediated+oxidative+stress+and+Nrf2-independent+NLRP3+and+NF-&#954;B+pathways.">Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-&#954;B pathways.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).</li><li>Im, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+orthotopic+lung+cancer+mouse+model+via+thoracotomy+and+orotracheal+intubation+enabling+in+vivo+imaging+studies.">Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies.</a> Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).</li><li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation:+description,+evaluation+and+comparison+with+transillumination.">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).</li><li>Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+orotracheal+intubation+in+mice.">Repeated orotracheal intubation in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60844 (2020).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+packaging+IL-1&#946;+and+TNF-&#945;+enhance+lung+inflammatory+response+to+mechanical+ventilation+in+part+by+induction+of+cofilin+signaling.">Microvesicles packaging IL-1&#946; and TNF-&#945; enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling.</a> International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).</li><li>Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+different+intratracheal+instillation+in+acute+lung+injury+model+of+mice.">Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice.</a> Jilin University. , (2010).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acute+lung+injury+mice+model+established+by+intranasal+and+intratracheal+instillation+of+lipopolysaccharide.">Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).</li><li>Luckow, B., Lehmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+bronchoalveolar+lavage+in+mice+by+orotracheal+intubation+avoiding+tracheotomy.">A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy.</a> BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).</li></ol>

Inicialmente, miramos dentro de la cavidad oral para encontrar la ubicación de la tráquea19. Sin embargo, durante este proceso, descubrimos que la tráquea de los ratones C57 / BL es estrecha, lo que dificulta encontrar la ubicación correcta por este método sin la ayuda de equipos como un endoscopio20. Tras una exploración adicional, descubrimos que la luz de la lámpara del intubador podría penetrar en la superficie del cuerpo, lo que permite al operador determinar l...

La lesión pulmonar aguda (LPA) es un síndrome clínico común. Bajo una variedad de factores patógenos, la ruptura de la barrera fisiológica de las células epiteliales pulmonares y las células endoteliales vasculares conduce a un aumento de la permeabilidad alveolar, causando así disminución de la distensibilidad pulmonar, edema pulmonar e hipoxemia grave1. El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es la forma más grave de LPA. La inflamación incontrolada y el daño por estrés oxidativo se consideran las principales causas de ALI y el SDRA más grave2. Cuando las células epiteliales alveolares se lesionan directamente debido a un traumatismo, se activa la cadena de respuesta inflamatoria de los macrófagos alveolares, lo que lleva a la inflamación en el pulmón3. A nivel mundial, hay más de 3 millones de pacientes con SDRA agudo por año, y representan aproximadamente el 10% de los ingresos en la unidad de cuidados intensivos; Además, la tasa de mortalidad en casos graves es tan alta como 46%4,5,6. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer un modelo animal adecuado de ALI para estudiar su patogénesis. El ratón es el animal experimental más utilizado en el estudio de la ALI, ya que su tracto respiratorio puede simular bien el tracto respiratorio humano para estudios de ALI. Además, ALI se manifiesta como infiltración masiva de células inflamatorias, aumento de la permeabilidad vascular pulmonar y edema pulmonar. Los cambios en las citocinas inflamatorias en suero y la relación pulmón peso seco-húmedo reflejan el grado de ALI7.
En la actualidad, los principales métodos para modelar la ALI inducida por LPS en ratones incluyen la intubación traqueal intranasal y quirúrgica 8,9. Aquí, proponemos un nuevo método para administrar LPS en la tráquea a través de la intubación orofaríngea no invasiva. Este método utiliza un intubador iluminado para encontrar la tráquea del ratón y luego administra LPS en la tráquea y el pulmón. Este método administra LPS a los pulmones con mayor precisión que el método de administración intranasal. En comparación con la intubación traqueal quirúrgica, este método no requiere cirugía, evita causar heridas y reduce el dolor en ratones10. Por lo tanto, este método se puede utilizar para establecer un modelo de ratón más convincente de ALI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>MERK</td>
			<td>L4130</td>
			<td>LPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringes</td>
			<td>SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD</td>
			<td>10028505008124</td>
			<td>To deliver LPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse cannula</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>803-03008-00</td>
			<td>Mouse cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse intubation kit</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>903-03027-00</td>
			<td>Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biosharp life science</td>
			<td>BS-XG-03</td>
			<td>To verify the success of intubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Beijing Chemical Co., China</td>
			<td>20220918</td>
			<td>To anesthetize mice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice

El modelo de ratón de lesión pulmonar aguda (ALI) inducido por lipopolisacárido (LPS) o endotoxina sigue siendo uno de los modelos más utilizados en estudios con animales de lesión pulmonar aguda o inflamación aguda. Los métodos actuales más utilizados en modelos de ratón con lesión pulmonar aguda son una inyección intraperitoneal de LPS y una traqueostomía para la infusión traqueal de LPS. Sin embargo, el primer método carece de orientación pulmonar y daña otros órganos, y el segundo método induce trauma operatorio, riesgo de infección y una baja tasa de supervivencia. Aquí, recomendamos un método no invasivo de intubación endotraqueal orofaríngea para la instilación de LPS en ratones. En este método, el LPS se introduce de forma no invasiva en la tráquea a través de la cavidad orofaríngea para ser instilado en el pulmón con la ayuda de un aparato para la intubación endotraqueal. Este método no solo asegura la orientación pulmonar, sino que también evita el daño y el riesgo de muerte en los animales. Esperamos que este enfoque se utilice ampliamente en el campo de la lesión pulmonar aguda.

El método propuesto para la instilación de LPS en ratones se verificó evaluando la expresión de la citoquina inflamatoria TNF-α y la relación de peso seco-húmedo del pulmón 12 h después de la instilación de LPS. Hubo cuatro grupos en el experimento: control en blanco (sin ningún tratamiento), intubación quirúrgica16, intranasal17,18 e intubación orofaríngea no invasiva (n = 6). En comparació...

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Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

Nuestro protocolo propone un nuevo método de administración no invasivo de LPS desde la tráquea hasta el pulmón, con mayor precisión. Las personas que están probando este método por primera vez deben poner mucho esfuerzo en encontrar la posición de la tráquea. Para preparar la plataforma de intubación, pase la cuerda a través de los dos orificios y ate sus extremos a las pequeñas protuberancias en la parte superior del elevador.Luego, coloque dos bandas elásticas en cada extremo del clip y péguelas con cinta adhesiva a la parte posterior del elevador. Finalmente, fije el elevador a la base en un ángulo de 90 grados. Ensamble la cánula en una cánula y encienda la luz de la pluma.A continuación, desinfecte las pinzas quirúrgicas pequeñas y la pipeta Pasteur con alcohol al 70%. Para preparar la solución del compuesto de prueba, agregue tres miligramos de lipopolisacárido, o LPS, en un mililitro de pH 7.2 PBS. Luego, disuelva 10 miligramos de pentobarbital sódico en un mililitro de solución salina normal y filtre la solución con un filtro de jeringa de 0.45 micrómetros.Coloque el ratón anestesiado en la plataforma de intubación. Luego fije los dientes frontales superiores con la cuerda y los dos antepiés con las bandas elásticas. Usando pinzas, saque la lengua y sosténgala.Empuje la cánula lentamente a lo largo de la boca hasta la epiglotis mandibular. Localice la tráquea con la luz de la cánula e inserte lentamente la cánula en ella. Luego retire la pluma de intubación, dejando la cánula dentro.Inserte la pipeta Pasteur en la junta de la cánula y presione el cabezal. Después de una intubación endotraqueal exitosa, usando una microjeringa de cabeza plana, instilar la solución de LPS preparada a una dosis de tres miligramos por kilogramo a través de la cánula. Una vez terminado, saca la microjeringa y la cánula.Retire el ratón de la plataforma de intubación y colóquelo en una jaula separada para recuperarse. Observar el estado respiratorio del ratón hasta que se recupere y recupere la conciencia. A las 12 horas después de la instilación traqueal LPS, se evaluó la expresión de una citoquina inflamatoria, TNF-alfa, y la relación pulmón seco-peso húmedo y se compararon con otros métodos de instilación.Los niveles séricos de TNF-alfa en el grupo de intubación orofaríngea no invasiva aumentaron significativamente en comparación con el grupo control en blanco. La relación pulmón de peso seco-húmedo también aumentó, alcanzando el mismo nivel que en el grupo de intubación traqueal quirúrgica. Es importante no rayar la tráquea en el proceso de encontrar la ubicación de la tráquea.La técnica también podría usarse para administrar otros medicamentos que necesitan llegar al pulmón de una manera no invasiva.

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