Name: evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, nr. 32070924 og 32000651 fra NSFC og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 fra Natural Science Foundation Project Program of Chongqing.

Dyreforsøgene blev udført på baggrund af manualen om brug og pleje af forsøgsdyr og blev godkendt af laboratoriedyrs velfærd og etiske komité ved det tredje militære medicinske universitet. Hunmus med Balb/c, 6-8 uger gamle, blev anvendt til nærværende undersøgelse. Dyrene blev hentet fra kommercielle kilder (se materialetabel).
1. Fremstilling af MRSA HI antigenproteinet
<ol><li>Få IsdB- og Hla-kloner fra kommercielle kilder (se materialetabel), ...

<ol>
	<li>Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+virulence+of+Staphylococcus+aureus.">Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus.</a> Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).</li><li>Lakhundi, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus:+molecular+characterization,+evolution,+and+epidemiology.">Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology.</a> Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).</li><li>Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+antibiotic+resistance:+the+most+critical+pathogens.">Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens.</a> Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).</li><li>Goull&#233;, J. P., Grangeot-Keros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aluminum+and+vaccines:+Current+state+of+knowledge.">Aluminum and vaccines: Current state of knowledge.</a> Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+safety:+myths+and+misinformation.">Vaccine safety: myths and misinformation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+a+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Chen, B. H., Inbaraj, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion+and+nanoliposome+based+strategies+for+improving+anthocyanin+stability+and+bioavailability.">Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability.</a> Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).</li><li>Zuo, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+protective+immunity+of+a+novel+subunit+fusion+vaccine+in+a+murine+model+of+systemic+MRSA+infection.">Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection.</a> PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).</li><li>Sun, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>National Pharmacopoeia Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunodominant+epitope-specific+monoclonal+antibody+cocktail+improves+survival+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+bacteremia.">An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia.</a> The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).</li><li>Roy, U., Kornitzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme-iron+acquisition+in+fungi.">Heme-iron acquisition in fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+toxins+in+musculoskeletal+infections.">Bacterial toxins in musculoskeletal infections.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).</li><li>Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+in+vivo+evaluation+of+baicalin-loaded+W/O+nanoemulsion+for+lymphatic+absorption.">Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).</li><li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+Concepts,+development+and+applications+in+drug+delivery.">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).</li><li>Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+modeling+and+experimental+validation+of+nanoemulsion-based+drug+transport+across+cellular+barriers.">Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers.</a> Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential-What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential-What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Francis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+vaccine+technologies.">Recent advances in vaccine technologies.</a> The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).</li><li>Tripathi, N. K., Shrivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+recombinant+protein-based+dengue+vaccines.">Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).</li><li>Wilder-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+vaccine+development:+status+and+future.">Dengue vaccine development: status and future.</a> Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).</li><li>Korneev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+sepsis+and+septic+shock.">Mouse models of sepsis and septic shock.</a> Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).</li></ol>

IsdB, et bakterielt cellevægforankret og jernreguleret overfladeprotein, spiller en vigtig rolle i processen med at opnå hæmjern15. Hla, alfa-toksin, er blandt de mest effektive bakterielle toksiner, der er kendt i MRSA, og kan danne porer i eukaryote celler og forstyrre vedhæftning og epitelceller16. I vores undersøgelse blev et nyt rekombinations-MRSA-antigenprotein (HI) konstrueret og udtrykt med genteknologiteknologi baseret på antigengenerne fra...

Methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) er et opportunistisk patogen med en af de højeste infektionsrater på en intensivafdeling (ICU) afdeling1, kardiologiske afdelinger og brandsårsafdelinger over hele verden. MRSA udviser høje infektionsrater, dødelighed og bred lægemiddelresistens, hvilket giver store vanskeligheder ved klinisk behandling2. På den globale prioritetsliste over antibiotikaresistente bakterier, der blev frigivet af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) i 2017, blev MRSA opført i den mest kritiske kategori3. Der er derfor et presserende behov for en vaccine mod MRSA-infektion.
Aluminiumadjuvans er blevet brugt i lang tid, og adjuvanshjælpemekanismen er relativt klar, sikker, effektiv og godt tolereret4. Aluminium adjuvanser er i øjeblikket en meget anvendt type adjuvans. Det antages generelt, at antigener adsorberet på aluminiumsaltpartikler kan forbedre stabiliteten og forbedre injektionsstedets evne til at optage antigener, hvilket giver god absorption og langsom frigivelse5. I øjeblikket er den største ulempe ved aluminiumadjuvanser, at de mangler en adjuvansvirkning eller kun udviser en svag adjuvansvirkning på nogle vaccinekandidatantigener6. Derudover inducerer aluminiumadjuvanser IgE-medierede overfølsomhedsreaktioner5. Derfor er det nødvendigt at udvikle nye adjuvanser for at stimulere et stærkere immunrespons.
Nanoemulsionsadjuvanser er kolloide dispersionssystemer sammensat af olie, vand, overfladeaktive stoffer og cosuraktive stoffer7. Derudover er adjuvanserne termodynamisk stabile og isotrope, kan autoklaveres eller stabiliseres ved højhastighedscentrifugering og kan dannes spontant under milde præparationsbetingelser. Flere emulsionsadjuvanser (såsom MF59, NB001-002-serien, AS01-04-serien osv.) er i øjeblikket på markedet eller i klinisk forskningsfase, men deres partikelstørrelser er større end 160 nm8. Derfor kan fordelene ved lægemidler i nanoskala (1-100 nm) (dvs. stort specifikt overfladeareal, lille partikelstørrelse, overfladeeffekt, høj overfladeenergi, lille størrelseseffekt og makrokvantetunneleffekt) ikke udnyttes fuldt ud. I denne protokol er det rapporteret, at en ny adjuvans baseret på nanoemulsionsteknologi med en diameterstørrelse på 1-100 nm udviser god adjuvansaktivitet9. Vi testede rekombinationsunderenheden vaccine antigenprotein HI (α-hæmolysinmutant [Hla] og Fe ion overflade bestemmelse faktor B [IsdB] underenhed N2 aktivt fragmentfusionsprotein); En række procedurer blev etableret for at undersøge de fysiske egenskaber og stabilitet, evaluere dets specifikke antistofrespons efter intramuskulær administration og teste vaccinens beskyttende virkning ved hjælp af en musesystemisk infektionsmodel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5424000495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Dimension FastScan</td>
			<td>BRUKER, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China</td>
			<td>YBS-AA-11408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice&#160;</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China</td>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Competent Cell</td>
			<td>Merck millipore,Germany</td>
			<td>70232-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-100G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie bright blue G-250 staining solution</td>
			<td>MIKX,China</td>
			<td>DB236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorization solution</td>
			<td>BOSTER,China</td>
			<td>AR0163-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420</td>
			<td>Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>DYCZ-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel image</td>
			<td>Tanon, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione-Sepharose Resin GST</td>
			<td>Mei5bio,China</td>
			<td>affinity chromatography resin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI recombinant protein</td>
			<td>Third Military Medical University,China</td>
			<td>110-27-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP -Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03002R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03003R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Haimen Feiyue Co.,LTD,China</td>
			<td>YR-JZH-1UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsdB and Hla clones</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl- &#946;-D-1-mercaptogalactopyranoside</td>
			<td>fdbio,China</td>
			<td>FD3278-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB bouillon culture-medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lnfrared physiotherapy lamp</td>
			<td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China</td>
			<td>7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(A) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(B) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro plate washing machine 405 LSRS</td>
			<td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&#160; Park,USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument</td>
			<td>BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC packing</td>
			<td>TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD</td>
			<td>0022818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRSA252</td>
			<td>USA, ATCC</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit</td>
			<td>DAKEWE, China</td>
			<td>8012011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR, Amplifier</td>
			<td>Thermal Cycler, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-target gene recombinant plasmid</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>B3528G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>G-CLONE, China</td>
			<td>CS1231-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>3120000844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>K400327-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera</td>
			<td>null</td>
			<td>See Reference 11 for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P4347-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Thermo Scientufuc, USA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF TRANSFER MEMBRANE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL,Japan</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Merck,Germany</td>
			<td>Tc-P8411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos L120C TEM</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB color solution</td>
			<td>TIAN GEN, China</td>
			<td>PA107-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turtle kits</td>
			<td>Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD</td>
			<td>ES80545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection

Nanoemulsionsadjuvansvacciner har tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af deres lille partikelstørrelse, høj termisk stabilitet og evne til at fremkalde gyldigt immunrespons. Imidlertid er etablering af en række omfattende protokoller til evaluering af immunresponset af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine afgørende. Derfor indeholder denne artikel en streng procedure til bestemmelse af en vaccines fysisk-kemiske egenskaber (ved transmissionselektronmikroskopi [TEM], atomkraftmikroskopi [AFM] og dynamisk lysspredning [DLS]), stabiliteten af vaccineantigenet og systemet (ved en højhastighedscentrifugetest, en termodynamisk stabilitetstest, SDS-PAGE og western blot) og det specifikke immunrespons (IgG1, IgG2a og IgG2b). Ved hjælp af denne tilgang kan forskere nøjagtigt evaluere den beskyttende virkning af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine i en dødelig MRSA252 musemodel. Med disse protokoller kan den mest lovende nanoemulsionsvaccineadjuvans med hensyn til effektivt adjuvanspotentiale identificeres. Derudover kan metoderne hjælpe med at optimere nye vacciner til fremtidig udvikling.

Protokollen til fremstilling af nanoemulsionsadjuvansvaccinen og in vitro- og in vivo-test af denne vaccine blev evalueret. TEM, AFM og DLS blev brugt til at bestemme de vigtige egenskaber ved zetapotentialet og partikelstørrelsen på overfladen af denne prøve (figur 1). SDS-PAGE og western blotting viste, at mængden af antigen i bundfaldet og supernatanten ikke nedbrydes signifikant efter centrifugering, hvilket indikerede, at vaccinen var strukturelt intakt, specifik o...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection at JoVE.com

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection

Denne protokol forbereder og evaluerer de fysiske egenskaber, immunrespons og in vivo beskyttende virkning af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine.

Evaluering af immunresponset af en nanoemulsionsadjuvansvaccine mod methicillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) infektion

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

Den demonstrerede protokol understregede den direkte og effektive eksperimentelle tilgang og de detaljerede trin til immunresponseffekter af nye virale adjuvanser. Denne protokol giver forskningen ikke kun en grundlæggende immunevalueringsmetode til adjuverende vaccine, men kan også bestemme deres massestabilitet. Til at begynde med skal du tage 10 milligram pr. milliliter arbejdsløsning af MRSA HI-antigenproteinet og til det sekventielt tilføje de tre hjælpestoffer, isopropylmyristat, polyoxyethylenricinusolie og propylenglycol, idet der opretholdes et masseforhold på en er til seks er til tre.Rør blandingen godt, og tilsæt derefter gradvist steriliseret rent vand for at nå et systemvolumen på 10 ml. For at forberede nanoemulsionsvaccinen ved lavenergiemulgeringsmetode omrøres den ved 500 rotationer pr. Minut og 25 grader Celsius i ca. 20 minutter. Derefter opnås nanoemulsionsvaccinen indeholdende et milligram pr. milliliter protein som en klar gennemsigtig væske.Til antigenbelægning af det enzymbundne immunosorbentassay eller ELISA-pladen fortyndes HI-proteinantigen til 10 mikrogram pr. ml med coatingopløsning, og der tilsættes 100 mikroliter fortyndet antigen pr. hul i ELISA-pladen. Inkuber pladen ved fire grader Celsius natten over. Efter inkubation vaskes pladen med 300 mikroliter PBST pr. Brønd.Forsegl brøndene med 300 mikroliter tætningsopløsning pr. Brønd i to timer ved 37 grader Celsius, fortynd derefter tre mikroliter museserum fra hver forsøgsgruppe 100 gange ved tilsætning af 297 mikroliter PBST og hvirvel det fortyndede serum. Der tilsættes 100 mikroliter fortyndet serum pr. hul i den coatede ELISA-plade for hver serumprøve. På samme måde fortyndes de positive og negative kontrolserum 100 gange med PBST ved at tilsætte fire mikroliter positivt eller negativt kontrolserum til 396 mikroliter PBST efterfulgt af hvirvelblanding.For at udføre fortynding med dobbelt forhold tilsættes 200 mikroliter af det tidligere fortyndede eksperimentelle serum til den første række af den coatede ELISA-plade, og derefter tilsættes 100 mikroliter PBST til alle huller, undtagen dem i række et og 12. Derefter justeres pipettepistolen til 100 mikroliter og overføres 100 mikroliter serum fra første række til anden række indeholdende PBST. Bland indholdet i anden række 10 gange ved hjælp af pipettepistolen.Tilsvarende udføres en er til to på hinanden følgende fortyndinger af serum til række 11. Når du er færdig, kasseres 100 mikroliter væske fra række 11. Der tilsættes 100 mikroliter fortyndet negativt og positivt serum til hvert tilsvarende hul i række 12 efter prøveskabelonen.ELISA-pladen forsegles med plastfolie og inkuberes ved 37 grader Celsius i en time. I mellemtiden fortyndes sekundært antistof anti-mus IgG HRP 10.000 gange ved at tilføje PBST. Efter en times inkubation vaskes ELISA-pladen med 300 mikroliter PBST pr. brønd for at rense de ubundne antistoffer, derefter tilsættes 100 mikroliter af det fortyndede sekundære antistof til hvert hul og inkuberes pladen ved 37 grader Celsius i 40 minutter.Vask pladen med 300 mikroliter PBST pr. Brønd, og tilsæt derefter 100 mikroliter TMB-farveudviklingsopløsning til hvert hul. Placer pladerne ved 37 grader Celsius og væk fra lys i 10 minutter. Derefter afsluttes reaktionen straks med 50 mikroliter to molær svovlsyre.Detekter den optiske densitet eller OD-værdier ved 415 nanometer ved hjælp af en enzymmarkør inden for 15 minutter efter afslutning. De fysiske egenskaber ved ny nanoemulsionsvaccine blev analyseret ved anvendelse af transmissionselektronmikroskopi og atomkraftmikroskopi. Dynamisk lysspredning blev anvendt til at bestemme partikelstørrelsesfordelingen og zetapotentialet af prøven.SDS-PAGE og western blotting viste, at mængden af antigen i bundfaldet og supernatanten ikke udskydes signifikant efter centrifugering, hvilket indikerer, at vaccinen var strukturelt intakt, specifik og immunogen. Nanoemulsionsadjuvansvaccinen øgede signifikant musenes samlede IgG-, IgG1- og IgG2a-antistoftitere. Immunogeniciteten af proteinvaccinen blev signifikant forbedret.Serumet IgG2b OD-værdier ved 450 nanometer var højest, når PBS blev brugt til en er til 5.000 fortynding. Den dødelige model af MRSA 252-mus afspejlede, at nanoemulsionsvaccinen viste en god beskyttende effekt og effektivt hæmmede bakteriel infektion med MRS A 252, hvilket forbedrede overlevelsesraten for inficerede mus. Forberedelsen af nanoemulgering og tilsætning af serum til planten er de vigtigste.Også hvor man detekterer antistoftiteren, skal man være opmærksom på at korrigere til en bredere og væskebaseret ud. Udover adjuvanser kan denne metode også bruges til immunudvikling af andre matematiske arrays, såsom plast eller leveringssystemer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Eksperimentel Endocarditis Model af Methicillin Resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) i rotte

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Vækst med humant hæmoglobin som en jernkilde

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay til Typing af stafylokokker Cassette Kromosom Mec Typer I til V i Methicillin-resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro analyse af MyD88-medieret Cellular immunrespons til West Nile Virus mutantstamme Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypebestemmelse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; ved Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metode for Studiet af horisontal genoverførsel i<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...