Name: evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00
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Cette recherche a été soutenue par le n ° 2021YFC2302603 du Programme national de recherche et de développement clé de la Chine, n ° 32070924 et 32000651 du NSFC et le n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing.

Les expériences sur les animaux ont été menées sur la base du manuel sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité de bien-être et d’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire. Des souris Balb/c femelles, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).
1. P...

<ol>
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IsdB, une protéine de surface ancrée dans la paroi cellulaire bactérienne et régulée par le fer, joue un rôle important dans le processus d’obtention du fer hémique15. Hla, toxine alpha, est parmi les toxines bactériennes les plus efficaces connues dans le SARM, et peut former des pores dans les cellules eucaryotes et interférer avec l’adhésion et les cellules épithéliales16. Dans notre étude, une nouvelle protéine antigénique SARM (IH) ...

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est un pathogène opportuniste avec l’un des taux d’infection les plus élevés dans les unités de soins intensifs (USI) des services 1, les services de cardiologie et lesservices de brûlures du monde entier. Le SARM présente des taux élevés d’infection, de mortalité et de résistance générale aux médicaments, ce qui présente de grandes difficultés dans le traitement clinique2. Dans la liste prioritaire mondiale des bactéries résistantes aux antibiotiques publiée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) en 2017, le SARM figurait dans la catégorie3 la plus critique. Un vaccin contre l’infection à SARM est donc nécessaire de toute urgence.
L’adjuvant d’aluminium est utilisé depuis longtemps et le mécanisme auxiliaire de l’adjuvant est relativement clair, sûr, efficace et bien toléré4. Les adjuvants à base d’aluminium sont actuellement un type d’adjuvant largement utilisé. On croit généralement que les antigènes adsorbés sur les particules de sel d’aluminium peuvent améliorer la stabilité et renforcer la capacité du site d’injection à absorber les antigènes, assurant une bonne absorption et une libération lente5. Actuellement, le principal inconvénient des adjuvants d’aluminium est qu’ils n’ont pas d’effet adjuvant ou ne présentent qu’un faible effet adjuvant sur certains antigènes candidats vaccins6. De plus, les adjuvants d’aluminium induisent des réactions d’hypersensibilité médiées par les IgE5. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouveaux adjuvants pour stimuler une réponse immunitaire plus forte.
Les adjuvants de nanoémulsion sont des systèmes de dispersion colloïdale composés d’huile, d’eau, de tensioactifs et de cosurfactants7. De plus, les adjuvants sont thermodynamiquement stables et isotropes, peuvent être autoclavés ou stabilisés par centrifugation à grande vitesse et peuvent se former spontanément dans des conditions de préparation douces. Plusieurs adjuvants d’émulsion (tels que MF59, série NB001-002, série AS01-04, etc.) sont actuellement sur le marché ou au stade de la recherche clinique, mais leur taille de particules est supérieure à 160 nm8. Par conséquent, les avantages des préparations médicinales à l’échelle nanométrique (1-100 nm) (c.-à-d. grande surface spécifique, petite taille de particules, effet de surface, énergie de surface élevée, effet de petite taille et effet tunnel macro-quantique) ne peuvent pas être pleinement exploités. Dans le protocole actuel, un nouvel adjuvant basé sur la technologie de nanoémulsion d’un diamètre de 1 à 100 nm a été signalé comme présentant une bonne activité adjuvante9. Nous avons testé la protéine antigénique du vaccin sous-unitaire de recombinaison HI (mutant de la α-hémolysine [Hla] et protéine de fusion de fragments actifs de la sous-unité N2 déterminant la surface des ions Fe ; Une série de procédures ont été établies pour examiner les propriétés physiques et la stabilité, évaluer sa réponse anticorps spécifique après administration intramusculaire et tester l’effet protecteur du vaccin à l’aide d’un modèle d’infection systémique chez la souris.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5424000495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Dimension FastScan</td>
			<td>BRUKER, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China</td>
			<td>YBS-AA-11408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice&#160;</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China</td>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Competent Cell</td>
			<td>Merck millipore,Germany</td>
			<td>70232-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-100G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie bright blue G-250 staining solution</td>
			<td>MIKX,China</td>
			<td>DB236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorization solution</td>
			<td>BOSTER,China</td>
			<td>AR0163-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420</td>
			<td>Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>DYCZ-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel image</td>
			<td>Tanon, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione-Sepharose Resin GST</td>
			<td>Mei5bio,China</td>
			<td>affinity chromatography resin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI recombinant protein</td>
			<td>Third Military Medical University,China</td>
			<td>110-27-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP -Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03002R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03003R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Haimen Feiyue Co.,LTD,China</td>
			<td>YR-JZH-1UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsdB and Hla clones</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl- &#946;-D-1-mercaptogalactopyranoside</td>
			<td>fdbio,China</td>
			<td>FD3278-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB bouillon culture-medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lnfrared physiotherapy lamp</td>
			<td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China</td>
			<td>7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(A) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(B) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro plate washing machine 405 LSRS</td>
			<td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&#160; Park,USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument</td>
			<td>BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC packing</td>
			<td>TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD</td>
			<td>0022818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRSA252</td>
			<td>USA, ATCC</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit</td>
			<td>DAKEWE, China</td>
			<td>8012011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR, Amplifier</td>
			<td>Thermal Cycler, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-target gene recombinant plasmid</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>B3528G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>G-CLONE, China</td>
			<td>CS1231-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>3120000844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>K400327-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera</td>
			<td>null</td>
			<td>See Reference 11 for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P4347-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Thermo Scientufuc, USA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF TRANSFER MEMBRANE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL,Japan</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Merck,Germany</td>
			<td>Tc-P8411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos L120C TEM</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB color solution</td>
			<td>TIAN GEN, China</td>
			<td>PA107-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turtle kits</td>
			<td>Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD</td>
			<td>ES80545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection

Les vaccins adjuvants à base de nanoémulsion ont attiré beaucoup d’attention en raison de leur petite taille de particules, de leur stabilité thermique élevée et de leur capacité à induire des réponses immunitaires valides. Cependant, il est essentiel d’établir une série de protocoles complets pour évaluer la réponse immunitaire d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion. Par conséquent, cet article présente une procédure rigoureuse pour déterminer les caractéristiques physico-chimiques d’un vaccin (par microscopie électronique à transmission [MET], microscopie à force atomique [AFM] et diffusion dynamique de la lumière [DLS]), la stabilité de l’antigène et du système vaccinaux (par un test de centrifugeuse à grande vitesse, un test de stabilité thermodynamique, SDS-PAGE et Western blot), et la réponse immunitaire spécifique (IgG1, IgG2a et IgG2b). En utilisant cette approche, les chercheurs peuvent évaluer avec précision l’effet protecteur d’un nouveau vaccin adjuvant de nanoémulsion dans un modèle murin MRSA252 mortel. Avec ces protocoles, l’adjuvant de vaccin nanoémulsion le plus prometteur en termes de potentiel adjuvant efficace peut être identifié. En outre, les méthodes peuvent aider à optimiser les nouveaux vaccins pour le développement futur.

Le protocole de préparation du vaccin adjuvant de nanoémulsion et les tests in vitro et in vivo de ce vaccin ont été évalués. La MET, l’AFM et le DLS ont été utilisés pour déterminer les caractéristiques importantes du potentiel zêta et de la taille des particules à la surface de cet échantillon (figure 1). SDS-PAGE et Western blot ont montré que la quantité d’antigène dans le précipité et le surnageant ne se dégradait pas significativement après la...

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Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection

Le présent protocole prépare et évalue les propriétés physiques, la réponse immunitaire et l’effet protecteur in vivo d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion.

Évaluation de la réponse immunitaire d’un vaccin adjuvant à base de nanoémulsion contre l’infection à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

Le protocole démontré soulignait l’approche expérimentale directe et efficace et les étapes détaillées des effets de réponse immunitaire des nouveaux adjuvants viraux. Ce protocole fournit à la recherche non seulement une méthode d’évaluation essentiellement immunitaire pour les vaccins adjuvants, mais peut également déterminer leur stabilité de masse. Pour commencer, prenez la solution de travail de 10 milligrammes par millilitre de la protéine antigénique SARM HI, et y ajoutez séquentiellement les trois excipients, le myristate d’isopropyle, l’huile de ricin de polyoxyéthylène et le propylène glycol, en maintenant un rapport massique de un est à six est à trois.Bien mélanger le mélange, puis ajouter progressivement de l’eau pure stérilisée pour atteindre un volume de système de 10 millilitres. Pour préparer le vaccin à nanoémulsion par une méthode d’émulsification à basse énergie, agitez-le à 500 rotations par minute et 25 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Par la suite, le vaccin à nanoémulsion contenant un milligramme par millilitre de protéine est obtenu sous forme de liquide transparent clair.Pour le revêtement antigénique du dosage immuno-enzymatique ou de la plaque ELISA, diluer l’antigène de la protéine HI à 10 microgrammes par millilitre avec une solution d’enrobage et ajouter 100 microlitres de l’antigène dilué par puits dans la plaque ELISA. Incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, laver la plaque avec 300 microlitres de PBST par puits.Sceller les puits avec 300 microlitres de solution d’étanchéité par puits pendant deux heures à 37 degrés Celsius, puis diluer trois microlitres de sérum de souris de chaque groupe expérimental 100 fois en ajoutant 297 microlitres de PBST et vorter le sérum dilué. Ajouter 100 microlitres de sérum dilué par puits dans la plaque ELISA enduite pour chaque échantillon de sérum. De même, diluez les sérums témoins positifs et négatifs 100 fois avec du PBST en ajoutant quatre microlitres de sérum témoin positif ou négatif à 396 microlitres de PBST, suivi d’un mélange de vortex.Pour effectuer une dilution à double rapport, ajoutez 200 microlitres du sérum expérimental préalablement dilué à la première rangée de la plaque ELISA revêtue, puis ajoutez 100 microlitres de PBST à tous les puits, à l’exception de ceux des rangées un et 12. Ensuite, réglez le pistolet à pipette à 100 microlitres et transférez 100 microlitres de sérum de la première rangée à la deuxième rangée contenant du PBST. Mélangez le contenu de la deuxième rangée 10 fois à l’aide du pistolet à pipette.De même, on effectue une telle à deux dilutions successives du sérum jusqu’à la rangée 11. Une fois cela fait, jetez 100 microlitres de liquide de la rangée 11. Ajouter 100 microlitres de sérum négatif et positif dilué à chaque puits correspondant de la ligne 12 en suivant le modèle d’échantillon.Scellez la plaque ELISA avec une pellicule plastique et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant ce temps, diluez l’anticorps secondaire anti-souris IgG HRP 10 000 fois en ajoutant PBST. Après l’incubation d’une heure, laver la plaque ELISA avec 300 microlitres de PBST par puits pour nettoyer les anticorps non liés, puis ajouter 100 microlitres de l’anticorps secondaire dilué à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes.Lavez la plaque avec 300 microlitres de PBST par puits, puis ajoutez 100 microlitres de solution de développement de couleur TMB à chaque puits. Placez les plaques à 37 degrés Celsius et à l’abri de la lumière pendant 10 minutes. Après quoi, terminez immédiatement la réaction avec 50 microlitres d’acide sulfurique molaire.Détecter la densité optique ou les valeurs OD à 415 nanomètres à l’aide d’un marqueur enzymatique dans les 15 minutes suivant la terminaison. Les caractéristiques physiques d’un nouveau vaccin à nanoémulsion ont été analysées à l’aide de la microscopie électronique à transmission et de la microscopie à force atomique. La diffusion dynamique de la lumière a été utilisée pour déterminer la distribution granulométrique et le potentiel zêta de l’échantillon.SDS-PAGE et Western blot ont montré que la quantité d’antigène dans le précipité et le surnageant ne différait pas significativement après la centrifugation, ce qui indique que le vaccin était structurellement intact, spécifique et immunogène. Le vaccin adjuvant à base de nanoémulsion a augmenté de manière significative les titres totaux d’anticorps IgG, IgG1 et IgG2a des souris. L’immunogénicité du vaccin protéique a été considérablement améliorée.Les valeurs sériques d’IgG2b OD à 450 nanomètres étaient les plus élevées lorsque le PBS était utilisé à une dilution de 5 000. Le modèle létal de souris SARM 252 a montré que le vaccin à nanoémulsion a montré un bon effet protecteur et inhibait efficacement l’infection bactérienne par MRS A 252, améliorant ainsi le taux de survie des souris infectées. La préparation de nanoémulsions et l’ajout de sérum à la plante sont les plus importants.En outre, lors de la détection du titre d’anticorps, il faut faire attention à corriger à une sortie plus large et à base liquide. Outre les adjuvants, cette méthode peut également être utilisée pour l’évolution immunitaire d’autres réseaux mathématiques, tels que les plastiques ou les systèmes d’administration.

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