Name: evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, nr. 32070924 og 32000651 av NSFC, og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 av Natural Science Foundation Project Program of Chongqing.

Dyreforsøkene ble utført basert på håndboken om bruk og stell av forsøksdyr og ble godkjent av Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee ved Third Military Medical University. Kvinnelige Balb / c mus, 6-8 uker gamle, ble brukt til denne studien. Dyrene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell).
1. Fremstilling av MRSA HI antigenprotein
<ol><li>Oppnå IsdB- og Hla-kloner fra kommersielle kilder (se materialtabell), utfør polymerasekjed...

<ol>
	<li>Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+virulence+of+Staphylococcus+aureus.">Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus.</a> Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).</li><li>Lakhundi, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus:+molecular+characterization,+evolution,+and+epidemiology.">Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology.</a> Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).</li><li>Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+antibiotic+resistance:+the+most+critical+pathogens.">Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens.</a> Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).</li><li>Goull&#233;, J. P., Grangeot-Keros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aluminum+and+vaccines:+Current+state+of+knowledge.">Aluminum and vaccines: Current state of knowledge.</a> Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+safety:+myths+and+misinformation.">Vaccine safety: myths and misinformation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+a+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Chen, B. H., Inbaraj, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion+and+nanoliposome+based+strategies+for+improving+anthocyanin+stability+and+bioavailability.">Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability.</a> Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).</li><li>Zuo, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+protective+immunity+of+a+novel+subunit+fusion+vaccine+in+a+murine+model+of+systemic+MRSA+infection.">Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection.</a> PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).</li><li>Sun, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>National Pharmacopoeia Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunodominant+epitope-specific+monoclonal+antibody+cocktail+improves+survival+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+bacteremia.">An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia.</a> The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).</li><li>Roy, U., Kornitzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme-iron+acquisition+in+fungi.">Heme-iron acquisition in fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+toxins+in+musculoskeletal+infections.">Bacterial toxins in musculoskeletal infections.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).</li><li>Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+in+vivo+evaluation+of+baicalin-loaded+W/O+nanoemulsion+for+lymphatic+absorption.">Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).</li><li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+Concepts,+development+and+applications+in+drug+delivery.">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).</li><li>Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+modeling+and+experimental+validation+of+nanoemulsion-based+drug+transport+across+cellular+barriers.">Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers.</a> Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential-What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential-What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Francis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+vaccine+technologies.">Recent advances in vaccine technologies.</a> The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).</li><li>Tripathi, N. K., Shrivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+recombinant+protein-based+dengue+vaccines.">Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).</li><li>Wilder-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+vaccine+development:+status+and+future.">Dengue vaccine development: status and future.</a> Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).</li><li>Korneev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+sepsis+and+septic+shock.">Mouse models of sepsis and septic shock.</a> Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).</li></ol>

IsdB, et bakteriecelleveggforankret og jernregulert overflateprotein, spiller en viktig rolle i prosessen med å skaffe hemejern15. Hla, alfatoksin, er blant de mest effektive bakterietoksinene som er kjent i MRSA, og kan danne porer i eukaryote celler og forstyrre adhesjon og epitelceller16. I vår studie ble et nytt rekombinasjon MRSA-antigenprotein (HI) konstruert og uttrykt med genteknologisk teknologi basert på antigengenene til IsdB og ...

Meticillinresistente gule stafylokokker (MRSA) er et opportunistisk patogen med en av de høyeste infeksjonsratene i en intensivavdeling (ICU) avdeling1, kardiologiske avdelinger og brannavdelinger over hele verden. MRSA viser høy forekomst av infeksjon, dødelighet og bred legemiddelresistens, noe som gir store vanskeligheter i klinisk behandling2. I den globale prioriteringslisten over antibiotikaresistente bakterier utgitt av Verdens helseorganisasjon (WHO) i 2017, ble MRSA oppført i den mest kritiske kategorien3. Det haster derfor med en vaksine mot MRSA-infeksjon.
Aluminiumadjuvans har vært brukt i lang tid, og den adjuvante hjelpemekanismen er relativt klar, sikker, effektiv og godt tolerert4. Aluminiumadjuvanser er for tiden en mye brukt type adjuvans. Det er generelt antatt at antigener adsorbert på aluminiumsaltpartikler kan forbedre stabiliteten og forbedre injeksjonsstedets evne til å ta opp antigener, noe som gir god absorpsjon og langsom frigjøring5. For tiden er den største ulempen med aluminiumadjuvanser at de mangler en adjuvans effekt eller bare utviser en svak adjuvant effekt på noen vaksinekandidatantigener6. I tillegg induserer aluminiumadjuvanser IgE-medierte hypersensitivitetsreaksjoner5. Derfor er det nødvendig å utvikle nye hjelpestoffer for å stimulere en sterkere immunrespons.
Nanoemulsjonsadjuvanser er kolloidale dispersjonssystemer sammensatt av olje, vann, overflateaktive midler og kosurfaktanter7. I tillegg er hjelpestoffene termodynamisk stabile og isotrope, kan autoklaveres eller stabiliseres ved høyhastighets sentrifugering, og kan dannes spontant under milde prepareringsforhold. Flere emulsjonsadjuvanser (som MF59, NB001-002-serien, AS01-04-serien, etc.) er for tiden på markedet eller i klinisk forskningsstadium, men deres partikkelstørrelser er større enn 160 nm8. Derfor kan fordelene ved medisinske preparater på nanoskala (1-100 nm) (dvs. stort spesifikt overflateareal, liten partikkelstørrelse, overflateeffekt, høy overflateenergi, liten størrelseseffekt og makrokvantetunneleffekt) ikke utnyttes fullt ut. I denne protokollen har en ny adjuvans basert på nanoemulsjonsteknologi med en diameterstørrelse på 1-100 nm blitt rapportert å vise god adjuvans aktivitet9. Vi testet rekombinasjon subenhet vaksine antigen protein HI (α-hemolysin mutant [Hla] og Fe ion overflatebestemmende faktor B [IsdB] subenhet N2 aktivt fragment fusjonsprotein); En rekke prosedyrer ble etablert for å undersøke de fysiske egenskapene og stabiliteten, evaluere den spesifikke antistoffresponsen etter intramuskulær administrering, og teste den beskyttende effekten av vaksinen ved hjelp av en systemisk infeksjonsmodell fra mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5424000495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Dimension FastScan</td>
			<td>BRUKER, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China</td>
			<td>YBS-AA-11408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice&#160;</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China</td>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Competent Cell</td>
			<td>Merck millipore,Germany</td>
			<td>70232-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-100G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie bright blue G-250 staining solution</td>
			<td>MIKX,China</td>
			<td>DB236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorization solution</td>
			<td>BOSTER,China</td>
			<td>AR0163-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420</td>
			<td>Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>DYCZ-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel image</td>
			<td>Tanon, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione-Sepharose Resin GST</td>
			<td>Mei5bio,China</td>
			<td>affinity chromatography resin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI recombinant protein</td>
			<td>Third Military Medical University,China</td>
			<td>110-27-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP -Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03002R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03003R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Haimen Feiyue Co.,LTD,China</td>
			<td>YR-JZH-1UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsdB and Hla clones</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl- &#946;-D-1-mercaptogalactopyranoside</td>
			<td>fdbio,China</td>
			<td>FD3278-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB bouillon culture-medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lnfrared physiotherapy lamp</td>
			<td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China</td>
			<td>7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(A) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(B) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro plate washing machine 405 LSRS</td>
			<td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&#160; Park,USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument</td>
			<td>BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC packing</td>
			<td>TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD</td>
			<td>0022818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRSA252</td>
			<td>USA, ATCC</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit</td>
			<td>DAKEWE, China</td>
			<td>8012011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR, Amplifier</td>
			<td>Thermal Cycler, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-target gene recombinant plasmid</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>B3528G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>G-CLONE, China</td>
			<td>CS1231-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>3120000844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>K400327-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera</td>
			<td>null</td>
			<td>See Reference 11 for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P4347-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Thermo Scientufuc, USA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF TRANSFER MEMBRANE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL,Japan</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Merck,Germany</td>
			<td>Tc-P8411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos L120C TEM</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB color solution</td>
			<td>TIAN GEN, China</td>
			<td>PA107-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turtle kits</td>
			<td>Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD</td>
			<td>ES80545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection

Nanoemulsjon adjuvante vaksiner har tiltrukket seg omfattende oppmerksomhet på grunn av sin lille partikkelstørrelse, høy termisk stabilitet og evne til å indusere valide immunresponser. Imidlertid er det viktig å etablere en rekke omfattende protokoller for å evaluere immunresponsen til en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine. Derfor inneholder denne artikkelen en streng prosedyre for å bestemme de fysisk-kjemiske egenskapene til en vaksine (ved transmisjonselektronmikroskopi [TEM], atomkraftmikroskopi [AFM] og dynamisk lysspredning [DLS]), stabiliteten til vaksineantigenet og systemet (ved en høyhastighets sentrifugetest, en termodynamisk stabilitetstest, SDS-PAGE og western blot) og den spesifikke immunresponsen (IgG1, IgG2a og IgG2b). Ved hjelp av denne tilnærmingen kan forskere nøyaktig evaluere den beskyttende effekten av en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine i en dødelig MRSA252 musemodell. Med disse protokollene kan den mest lovende nanoemulsjonsvaksineadjuvansen med hensyn til effektivt adjuvanspotensial identifiseres. I tillegg kan metodene bidra til å optimalisere nye vaksiner for fremtidig utvikling.

Protokollen for fremstilling av nanoemulsjonsadjuvant vaksine og in vitro og in vivo tester av denne vaksinen ble evaluert. TEM, AFM og DLS ble brukt til å bestemme de viktige egenskapene til zetapotensialet og partikkelstørrelsen på overflaten av denne prøven (figur 1). SDS-PAGE og western blotting viste at mengden antigen i bunnfallet og supernatanten ikke ble signifikant nedbrutt etter sentrifugering, noe som indikerte at vaksinen var strukturelt intakt, spesifikk o...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection at JoVE.com

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection

Den foreliggende protokollen forbereder og evaluerer de fysiske egenskapene, immunresponsen og in vivo beskyttende effekten av en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine.

Evaluering av immunresponsen til en nanoemulsjonsadjuvant vaksine mot meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) infeksjon

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

Den demonstrerte protokollen understreket den direkte og effektive eksperimentelle tilnærmingen og de detaljerte trinnene for immunresponseffekter av nye virale adjuvanser. Denne protokollen gir forskningen ikke bare en i utgangspunktet immunevalueringsmetode for adjuvant vaksine, men kan også bestemme deres massestabilitet. For å begynne, ta 10 milligram per milliliter arbeidsløsning av MRSA HI-antigenproteinet, og tilsett sekvensielt de tre hjelpestoffene, isopropylmyristat, polyoksyetylenricinusolje og propylenglykol, og opprettholder et masseforhold på en er til seks er til tre.Rør blandingen godt, tilsett deretter gradvis sterilisert rent vann for å nå et systemvolum på 10 milliliter. For å forberede nanoemulsjonsvaksinen ved lavenergiemulgeringsmetode, rør den ved 500 rotasjoner per minutt og 25 grader Celsius i ca. 20 minutter. Deretter oppnås nanoemulsjonsvaksinen inneholdende en milligram per milliliter protein som en klar gjennomsiktig væske.For antigenbelegg av enzymkoblet immunosorbentanalyse eller ELISA-plate, fortynn HI-proteinantigen til 10 mikrogram per milliliter med beleggoppløsning, og tilsett 100 mikroliter av det fortynnede antigenet per brønn i ELISA-platen. Inkuber platen ved fire grader Celsius over natten. Etter inkubering, vask platen med 300 mikroliter PBST per brønn.Forsegl brønnene med 300 mikroliter av tetningsløsningen per brønn i to timer ved 37 grader Celsius, fortynn deretter tre mikroliter av musserumet fra hver eksperimentell gruppe 100 ganger ved å tilsette 297 mikroliter PBST og virvel det fortynnede serumet. Tilsett 100 mikroliter fortynnet serum per brønn i den belagte ELISA-platen for hver serumprøve. På samme måte fortynner du de positive og negative kontrollserumene 100 ganger med PBST ved å tilsette fire mikroliter positivt eller negativt kontrollserum til 396 mikroliter PBST, etterfulgt av virvelblanding.For å utføre dobbeltforholdsfortynning, tilsett 200 mikroliter av det tidligere fortynnede eksperimentelle serumet til den første raden av den belagte ELISA-platen, og tilsett deretter 100 mikroliter PBST til alle brønner, unntatt de i rad en og 12. Deretter justerer du pipettepistolen til 100 mikroliter og overfører 100 mikroliter serum fra første rad til andre rad som inneholder PBST. Bland innholdet i andre rad 10 ganger ved hjelp av pipettepistolen.Tilsvarende utfører en er til to påfølgende fortynninger av serumet til rad 11. Når du er ferdig, kast 100 mikroliter væske fra rad 11. Tilsett 100 mikroliter fortynnet negativt og positivt serum til hver tilsvarende brønn i rad 12 etter prøvemalen.Forsegl ELISA-platen med plastfolie og inkuber ved 37 grader Celsius i en time. I mellomtiden, fortynn sekundært antistoff anti-mus IgG HRP 10, 000 ganger ved å legge til PBST. Etter en times inkubasjon, vask ELISA-platen med 300 mikroliter PBST per brønn for å rengjøre de ubundne antistoffene, tilsett deretter 100 mikroliter av det fortynnede sekundære antistoffet til hver brønn og inkuber platen ved 37 grader Celsius i 40 minutter.Vask platen med 300 mikroliter PBST per brønn, og tilsett deretter 100 mikroliter TMB fargeutviklingsløsning til hver brønn. Plasser platene ved 37 grader Celsius og vekk fra lys i 10 minutter. Deretter avsluttes reaksjonen umiddelbart med 50 mikroliter av to molare svovelsyre.Oppdag den optiske tettheten eller OD-verdiene ved 415 nanometer ved hjelp av en enzymmarkør innen 15 minutter etter avslutning. De fysiske egenskapene til ny nanoemulsjonsvaksine ble analysert ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi og atomkraftmikroskopi. Dynamisk lysspredning ble brukt til å bestemme partikkelstørrelsesfordelingen og zetapotensialet til prøven.SDS-PAGE og vestlig blotting viste at mengden antigen i bunnfallet og supernatanten ikke ble signifikant utsatt etter sentrifugering, noe som indikerer at vaksinen var strukturelt intakt, spesifikk og immunogen. Nanoemulsjonsadjuvansvaksinen økte signifikant de totale IgG-, IgG1- og IgG2a-antistofftiterne hos musene. Immunogeniteten til proteinvaksinen ble signifikant forbedret.Serum-IgG2b OD-verdiene ved 450 nanometer var høyest når PBS ble brukt på en er til 5000 fortynning. Den dødelige modellen av MRSA 252-mus reflekterte at nanoemulsjonsvaksinen viste en god beskyttende effekt og effektivt hemmet bakteriell infeksjon med MRS A 252, og forbedret overlevelsesgraden for infiserte mus. Fremstillingen av nanoemulsjon og tilsetning av serum til planten er det viktigste.Også der man oppdager antistofftiteren, bør man være oppmerksom på å korrigere til en bredere og væskebasert ut. Foruten adjuvanser, kan denne metoden også brukes til immunutvikling av andre matematiske arrays, for eksempel plast eller leveringssystemer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Eksperimentell Endokarditt Modell av Meticillin Resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) i Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Vekst med humant hemoglobin som en Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multipleks PCR-analyse for typing av stafylokokk Cassette Kromosom Mec Typer I til V i Meticillinresistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotyping av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; av Ribosomalt Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metodikk for studier av horisontal genoverføring i<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...