Name: evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por el No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China, el No. 32070924 y 32000651 del NSFC, y el No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing.

Los experimentos con animales se realizaron con base en el manual sobre el uso y cuidado de animales de experimentación y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar. Para el presente estudio se utilizaron ratones Balb/c hembra, de 6 a 8 semanas de edad. Los animales fueron obtenidos de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de la proteína antígeno MRSA HI</stron...

<ol>
	<li>Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+virulence+of+Staphylococcus+aureus.">Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus.</a> Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).</li><li>Lakhundi, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus:+molecular+characterization,+evolution,+and+epidemiology.">Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology.</a> Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).</li><li>Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+antibiotic+resistance:+the+most+critical+pathogens.">Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens.</a> Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).</li><li>Goull&#233;, J. P., Grangeot-Keros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aluminum+and+vaccines:+Current+state+of+knowledge.">Aluminum and vaccines: Current state of knowledge.</a> Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+safety:+myths+and+misinformation.">Vaccine safety: myths and misinformation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+a+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Chen, B. H., Inbaraj, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion+and+nanoliposome+based+strategies+for+improving+anthocyanin+stability+and+bioavailability.">Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability.</a> Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).</li><li>Zuo, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+protective+immunity+of+a+novel+subunit+fusion+vaccine+in+a+murine+model+of+systemic+MRSA+infection.">Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection.</a> PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).</li><li>Sun, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>National Pharmacopoeia Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunodominant+epitope-specific+monoclonal+antibody+cocktail+improves+survival+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+bacteremia.">An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia.</a> The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).</li><li>Roy, U., Kornitzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme-iron+acquisition+in+fungi.">Heme-iron acquisition in fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+toxins+in+musculoskeletal+infections.">Bacterial toxins in musculoskeletal infections.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).</li><li>Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+in+vivo+evaluation+of+baicalin-loaded+W/O+nanoemulsion+for+lymphatic+absorption.">Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).</li><li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+Concepts,+development+and+applications+in+drug+delivery.">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).</li><li>Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+modeling+and+experimental+validation+of+nanoemulsion-based+drug+transport+across+cellular+barriers.">Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers.</a> Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential-What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential-What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Francis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+vaccine+technologies.">Recent advances in vaccine technologies.</a> The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).</li><li>Tripathi, N. K., Shrivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+recombinant+protein-based+dengue+vaccines.">Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).</li><li>Wilder-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+vaccine+development:+status+and+future.">Dengue vaccine development: status and future.</a> Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).</li><li>Korneev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+sepsis+and+septic+shock.">Mouse models of sepsis and septic shock.</a> Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).</li></ol>

IsdB, una proteína de superficie bacteriana anclada a la pared celular y regulada por hierro, juega un papel importante en el proceso de obtención de hierro hemo15. Hla, toxina alfa, es una de las toxinas bacterianas más efectivas conocidas en MRSA, y puede formar poros en células eucariotas e interferir con la adhesión y las células epiteliales16. En nuestro estudio, se construyó una nueva proteína de antígeno MRSA (HI) de recombinación y se exp...

El Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) es un patógeno oportunista con una de las tasas de infección más altas en una unidad de cuidados intensivos (UCI) salas1, departamentos de cardiología y departamentos de quemaduras en todo el mundo. El SARM exhibe altas tasas de infección, mortalidad y amplia resistencia a los medicamentos, presentando grandes dificultades en el tratamiento clínico2. En la Lista de prioridad mundial de bacterias resistentes a los antibióticos publicada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2017, MRSA se incluyó en la categoría3 más crítica. Por lo tanto, se necesita urgentemente una vacuna contra la infección por SARM.
El adyuvante de aluminio se ha utilizado durante mucho tiempo, y el mecanismo auxiliar adyuvante es relativamente claro, seguro, efectivo y bien tolerado4. Los adyuvantes de aluminio son actualmente un tipo de adyuvante ampliamente utilizado. En general, se cree que los antígenos adsorbidos en partículas de sal de aluminio pueden mejorar la estabilidad y mejorar la capacidad del sitio de inyección para absorber antígenos, proporcionando una buena absorción y liberación lenta5. Actualmente, la principal desventaja de los adyuvantes de aluminio es que carecen de un efecto adyuvante o exhiben solo un efecto adyuvante débil en algunos antígenos candidatos a vacuna6. Además, los adyuvantes de aluminio inducen reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE5. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos adyuvantes para estimular una respuesta inmune más fuerte.
Los adyuvantes de nanoemulsión son sistemas de dispersión coloidal compuestos de aceite, agua, tensioactivos y cosurfactantes7. Además, los adyuvantes son termodinámicamente estables e isótropos, pueden ser esterilizados en autoclave o estabilizados por centrifugación de alta velocidad, y pueden formarse espontáneamente en condiciones de preparación suaves. Varios adyuvantes de emulsión (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) están actualmente en el mercado o en la etapa de investigación clínica, pero sus tamaños de partícula son superiores a 160 nm8. Por lo tanto, las ventajas de las preparaciones medicinales a nanoescala (1-100 nm) (es decir, área de superficie específica grande, tamaño de partícula pequeño, efecto de superficie, energía superficial alta, efecto de tamaño pequeño y efecto túnel macrocuántico) no pueden explotarse plenamente. En el presente protocolo, se ha informado que un nuevo adyuvante basado en tecnología de nanoemulsión con un tamaño de diámetro de 1-100 nm exhibe una buena actividad adyuvante9. Probamos la proteína HI del antígeno de la vacuna de la subunidad de recombinación (mutante de α-hemolisina [Hla] y la proteína de fusión de fragmentos activos de la subunidad N2 del factor de determinación de la superficie de iones Fe [IsdB]); Se establecieron una serie de procedimientos para examinar las propiedades físicas y la estabilidad, evaluar su respuesta específica de anticuerpos después de la administración intramuscular y probar el efecto protector de la vacuna utilizando un modelo de infección sistémica de ratón.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5424000495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Dimension FastScan</td>
			<td>BRUKER, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China</td>
			<td>YBS-AA-11408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice&#160;</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China</td>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Competent Cell</td>
			<td>Merck millipore,Germany</td>
			<td>70232-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-100G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie bright blue G-250 staining solution</td>
			<td>MIKX,China</td>
			<td>DB236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorization solution</td>
			<td>BOSTER,China</td>
			<td>AR0163-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420</td>
			<td>Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>DYCZ-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel image</td>
			<td>Tanon, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione-Sepharose Resin GST</td>
			<td>Mei5bio,China</td>
			<td>affinity chromatography resin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI recombinant protein</td>
			<td>Third Military Medical University,China</td>
			<td>110-27-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP -Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03002R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03003R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Haimen Feiyue Co.,LTD,China</td>
			<td>YR-JZH-1UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsdB and Hla clones</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl- &#946;-D-1-mercaptogalactopyranoside</td>
			<td>fdbio,China</td>
			<td>FD3278-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB bouillon culture-medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lnfrared physiotherapy lamp</td>
			<td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China</td>
			<td>7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(A) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(B) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro plate washing machine 405 LSRS</td>
			<td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&#160; Park,USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument</td>
			<td>BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC packing</td>
			<td>TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD</td>
			<td>0022818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRSA252</td>
			<td>USA, ATCC</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit</td>
			<td>DAKEWE, China</td>
			<td>8012011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR, Amplifier</td>
			<td>Thermal Cycler, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-target gene recombinant plasmid</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>B3528G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>G-CLONE, China</td>
			<td>CS1231-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>3120000844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>K400327-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera</td>
			<td>null</td>
			<td>See Reference 11 for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P4347-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Thermo Scientufuc, USA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF TRANSFER MEMBRANE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL,Japan</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Merck,Germany</td>
			<td>Tc-P8411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos L120C TEM</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB color solution</td>
			<td>TIAN GEN, China</td>
			<td>PA107-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turtle kits</td>
			<td>Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD</td>
			<td>ES80545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection

Las vacunas adyuvantes de nanoemulsión han atraído una gran atención debido a su pequeño tamaño de partícula, alta estabilidad térmica y capacidad para inducir respuestas inmunes válidas. Sin embargo, establecer una serie de protocolos integrales para evaluar la respuesta inmune de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión es vital. Por lo tanto, este artículo presenta un procedimiento riguroso para determinar las características fisicoquímicas de una vacuna (por microscopía electrónica de transmisión [TEM], microscopía de fuerza atómica [AFM] y dispersión dinámica de luz [DLS]), la estabilidad del antígeno y el sistema de la vacuna (mediante una prueba de centrífuga de alta velocidad, una prueba de estabilidad termodinámica, SDS-PAGE y western blot), y la respuesta inmune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando este enfoque, los investigadores pueden evaluar con precisión el efecto protector de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión en un modelo letal MRSA252 ratón. Con estos protocolos, se puede identificar el adyuvante de vacuna de nanoemulsión más prometedor en términos de potencial adyuvante efectivo. Además, los métodos pueden ayudar a optimizar nuevas vacunas para el desarrollo futuro.

Se evaluó el protocolo para la preparación de la vacuna adyuvante de nanoemulsión y las pruebas in vitro e in vivo de esta vacuna. Se utilizaron TEM, AFM y DLS para determinar las características importantes del potencial zeta y el tamaño de partícula en la superficie de esta muestra (Figura 1). SDS-PAGE y western blotting mostraron que la cantidad de antígeno en el precipitado y sobrenadante no se degradó significativamente después de la centrifugación, lo que in...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection at JoVE.com

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection

El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.

Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

El protocolo demostrado subrayó el enfoque experimental directo y efectivo y los pasos detallados para los efectos de la respuesta inmune de los nuevos adyuvantes virales. Este protocolo proporciona a la investigación no solo un método de evaluación básicamente inmune para la vacuna adyuvante, sino que también puede determinar su estabilidad masiva. Para comenzar, tome la solución de trabajo de 10 miligramos por mililitro de la proteína antígeno MRSA HI, y a ella, agregue secuencialmente los tres excipientes, miristato de isopropilo, aceite de ricino de polioxietileno y propilenglicol, manteniendo una relación de masa de uno es a seis es a tres.Revuelva bien la mezcla, luego agregue gradualmente agua pura esterilizada para alcanzar un volumen del sistema de 10 mililitros. Para preparar la vacuna de nanoemulsión por el método de emulsificación de baja energía, revuélvala a 500 rotaciones por minuto y 25 grados centígrados durante aproximadamente 20 minutos. Posteriormente, la vacuna de nanoemulsión que contiene un miligramo por mililitro de proteína se obtiene como un líquido transparente transparente.Para el recubrimiento de antígeno del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o placa ELISA, diluya el antígeno de la proteína HI a 10 microgramos por mililitro con solución de recubrimiento y agregue 100 microlitros del antígeno diluido por pocillo en la placa ELISA. Incubar el plato a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, lave la placa con 300 microlitros de PBST por pocillo.Selle los pocillos con 300 microlitros de la solución de sellado por pocillo durante dos horas a 37 grados centígrados, luego diluya tres microlitros del suero de ratones de cada grupo experimental 100 veces agregando 297 microlitros de PBST y vortice el suero diluido. Agregue 100 microlitros de suero diluido por pocillo en la placa ELISA recubierta para cada muestra de suero. Del mismo modo, diluya los sueros de control positivo y negativo 100 veces con PBST agregando cuatro microlitros de suero de control positivo o negativo a 396 microlitros de PBST, seguido de una mezcla de vórtice.Para realizar la dilución de doble proporción, agregue 200 microlitros del suero experimental previamente diluido a la primera fila de la placa ELISA recubierta, luego agregue 100 microlitros de PBST a todos los pocillos, excepto los de las filas uno y 12. A continuación, ajuste la pistola de pipetas a 100 microlitros y transfiera 100 microlitros de suero de la primera fila a la segunda fila que contiene PBST. Mezcle el contenido de la segunda fila 10 veces con la pipeta.Del mismo modo, realizar una es a dos diluciones sucesivas del suero hasta la fila 11. Una vez hecho esto, deseche 100 microlitros de líquido de la fila 11. Agregue 100 microlitros de suero negativo y positivo diluido a cada pocillo correspondiente en la fila 12 siguiendo la plantilla de muestra.Selle la placa ELISA con una envoltura de plástico e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Mientras tanto, diluya el anticuerpo secundario anti-ratón IgG HRP 10, 000 veces agregando PBST. Después de la incubación de una hora, lave la placa ELISA con 300 microlitros de PBST por pocillo para limpiar los anticuerpos no unidos, luego agregue 100 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante 40 minutos.Lave la placa con 300 microlitros de PBST por pocillo, luego agregue 100 microlitros de solución de desarrollo de color TMB a cada pocillo. Coloque las placas a 37 grados centígrados y lejos de la luz durante 10 minutos. Después de lo cual, termine la reacción inmediatamente con 50 microlitros de dos molares de ácido sulfúrico.Detecte la densidad óptica o los valores de OD a 415 nanómetros utilizando un marcador enzimático dentro de los 15 minutos posteriores a la terminación. Las características físicas de la nueva vacuna de nanoemulsión se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión y microscopía de fuerza atómica. Se utilizó la dispersión dinámica de la luz para determinar la distribución del tamaño de partícula y el potencial zeta de la muestra.SDS-PAGE y western blotting mostraron que la cantidad de antígeno en el precipitado y el sobrenadante no difirió significativamente después de la centrifugación, lo que indica que la vacuna estaba estructuralmente intacta, específica e inmunogénica. La vacuna adyuvante de nanoemulsión aumentó significativamente los títulos totales de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG2a de los ratones. La inmunogenicidad de la vacuna proteica mejoró significativamente.Los valores séricos de IgG2b OD a 450 nanómetros fueron más altos cuando se utilizó PBS a una dilución de uno es a 5, 000. El modelo letal de ratones MRSA 252 reflejó que la vacuna de nanoemulsión mostró un buen efecto protector e inhibió eficazmente la infección bacteriana con MRS A 252, mejorando la tasa de supervivencia de los ratones infectados. La preparación de la nanoemulsión y la adición de suero a la planta son los más importantes.Además, cuando se detecta el título de anticuerpos, se debe prestar atención a corregir a una salida más amplia y líquida. Además de los adyuvantes, este método también se puede utilizar para la evolución inmune de otras matrices matemáticas, como plásticos o sistemas de entrega.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

El uso de un flujo de goteo y la rotación del disco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Investigación

Inmunología e Infección

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subcutánea infección de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Modelo experimental de endocarditis Resistente a la Meticilina<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (SARM) en la rata

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Ensayo para la tipificaci

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotipado de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribosómica espaciador de PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metodología para el Estudio de la transferencia horizontal de genes en<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...