Name: evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection at JoVE.com

Denna forskning stöddes av nr 2021YFC2302603 i Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram, nr 32070924 och 32000651 i NSFC och nr 2019jcyjA-msxmx0159 i Natural Science Foundation Project Program of Chongqing.

Djurförsöken utfördes utifrån handboken om användning och skötsel av försöksdjur och godkändes av Försöksdjurens välfärds- och etikkommitté vid Tredje Militärmedicinska Högskolan. Kvinnliga Balb / c-möss, 6-8 veckor gamla, användes för den aktuella studien. Djuren erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning).
1. Beredning av MRSA HI-antigenproteinet
<ol><li>Skaffa IsdB- och Hla-kloner från kommersiella källor (se <strong...

<ol>
	<li>Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+virulence+of+Staphylococcus+aureus.">Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus.</a> Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).</li><li>Lakhundi, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus:+molecular+characterization,+evolution,+and+epidemiology.">Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology.</a> Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).</li><li>Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+antibiotic+resistance:+the+most+critical+pathogens.">Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens.</a> Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).</li><li>Goull&#233;, J. P., Grangeot-Keros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aluminum+and+vaccines:+Current+state+of+knowledge.">Aluminum and vaccines: Current state of knowledge.</a> Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+safety:+myths+and+misinformation.">Vaccine safety: myths and misinformation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+a+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Chen, B. H., Inbaraj, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion+and+nanoliposome+based+strategies+for+improving+anthocyanin+stability+and+bioavailability.">Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability.</a> Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).</li><li>Zuo, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+protective+immunity+of+a+novel+subunit+fusion+vaccine+in+a+murine+model+of+systemic+MRSA+infection.">Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection.</a> PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).</li><li>Sun, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>National Pharmacopoeia Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunodominant+epitope-specific+monoclonal+antibody+cocktail+improves+survival+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+bacteremia.">An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia.</a> The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).</li><li>Roy, U., Kornitzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme-iron+acquisition+in+fungi.">Heme-iron acquisition in fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+toxins+in+musculoskeletal+infections.">Bacterial toxins in musculoskeletal infections.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).</li><li>Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+in+vivo+evaluation+of+baicalin-loaded+W/O+nanoemulsion+for+lymphatic+absorption.">Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).</li><li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+Concepts,+development+and+applications+in+drug+delivery.">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).</li><li>Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+modeling+and+experimental+validation+of+nanoemulsion-based+drug+transport+across+cellular+barriers.">Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers.</a> Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential-What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential-What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Francis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+vaccine+technologies.">Recent advances in vaccine technologies.</a> The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).</li><li>Tripathi, N. K., Shrivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+recombinant+protein-based+dengue+vaccines.">Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).</li><li>Wilder-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+vaccine+development:+status+and+future.">Dengue vaccine development: status and future.</a> Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).</li><li>Korneev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+sepsis+and+septic+shock.">Mouse models of sepsis and septic shock.</a> Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).</li></ol>

IsdB, ett bakteriecellväggförankrat och järnreglerat ytprotein, spelar en viktig roll i processen att erhålla hemjärn15. Hla, alfatoxin, är bland de mest effektiva bakterietoxiner som är kända i MRSA och kan bilda porer i eukaryota celler och störa vidhäftning och epitelceller16. I vår studie konstruerades och uttrycktes ett nytt rekombinations-MRSA-antigenprotein (HI) med genteknik baserad på antigengenerna IsdB och Hla. Där...

Meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) är en opportunistisk patogen med en av de högsta infektionshastigheterna på en intensivvårdsavdelning (ICU) avdelning1, kardiologiska avdelningar och brännavdelningar över hela världen. MRSA uppvisar höga infektionsnivåer, dödlighet och bred läkemedelsresistens, vilket medför stora svårigheter vid klinisk behandling2. I den globala prioriteringslistan över antibiotikaresistenta bakterier som släpptes av Världshälsoorganisationen (WHO) 2017 listades MRSA i den mest kritiska kategori3. Det finns därför ett akut behov av ett vaccin mot MRSA-infektion.
Aluminiumadjuvans har använts under lång tid, och adjuvanshjälpmekanismen är relativt tydlig, säker, effektiv och väl tolererad4. Aluminiumadjuvans är för närvarande en allmänt använd typ av adjuvans. Det anses allmänt att antigener adsorberade på aluminiumsaltpartiklar kan förbättra stabiliteten och förbättra injektionsställets förmåga att ta upp antigener, vilket ger god absorption och långsam frisättning5. För närvarande är den största nackdelen med aluminiumadjuvans att de saknar en adjuvanseffekt eller endast uppvisar en svag adjuvanseffekt på vissa vaccinkandidatantigener6. Dessutom inducerar aluminiumadjuvans IgE-medierade överkänslighetsreaktioner5. Därför är det nödvändigt att utveckla nya adjuvans för att stimulera ett starkare immunsvar.
Nanoemulsionsadjuvans är kolloidala dispersionssystem som består av olja, vatten, ytaktiva ämnen och kosurakter7. Dessutom är adjuvanserna termodynamiskt stabila och isotropa, kan autoklaveras eller stabiliseras genom höghastighetscentrifugering och kan bildas spontant under milda beredningsförhållanden. Flera emulsionsadjuvans (såsom MF59, NB001-002-serien, AS01-04-serien, etc.) finns för närvarande på marknaden eller i det kliniska forskningsstadiet, men deras partikelstorlekar är större än 160 nm8. Därför kan fördelarna med läkemedel i nanoskala (1-100 nm) (dvs. stor specifik yta, liten partikelstorlek, yteffekt, hög ytenergi, liten storlekseffekt och makrokvanttunneleffekt) inte utnyttjas fullt ut. I det aktuella protokollet har ett nytt adjuvans baserat på nanoemulsionsteknik med en diameterstorlek på 1-100 nm rapporterats uppvisa god adjuvansaktivitet9. Vi testade rekombinationssubenhetsvaccinantigenproteinet HI (α-hemolysinmutant [Hla] och Fe-jonytbestämmande faktor B [IsdB] subenhet N2 aktivt fragmentfusionsprotein); En rad procedurer fastställdes för att undersöka de fysikaliska egenskaperna och stabiliteten, utvärdera dess specifika antikroppssvar efter intramuskulär administrering och testa vaccinets skyddande effekt med hjälp av en mussystemisk infektionsmodell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5424000495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Dimension FastScan</td>
			<td>BRUKER, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China</td>
			<td>YBS-AA-11408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice&#160;</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China</td>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Competent Cell</td>
			<td>Merck millipore,Germany</td>
			<td>70232-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-100G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie bright blue G-250 staining solution</td>
			<td>MIKX,China</td>
			<td>DB236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorization solution</td>
			<td>BOSTER,China</td>
			<td>AR0163-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420</td>
			<td>Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>DYCZ-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel image</td>
			<td>Tanon, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione-Sepharose Resin GST</td>
			<td>Mei5bio,China</td>
			<td>affinity chromatography resin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI recombinant protein</td>
			<td>Third Military Medical University,China</td>
			<td>110-27-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP -Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03002R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03003R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Haimen Feiyue Co.,LTD,China</td>
			<td>YR-JZH-1UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsdB and Hla clones</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl- &#946;-D-1-mercaptogalactopyranoside</td>
			<td>fdbio,China</td>
			<td>FD3278-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB bouillon culture-medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lnfrared physiotherapy lamp</td>
			<td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China</td>
			<td>7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(A) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(B) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro plate washing machine 405 LSRS</td>
			<td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&#160; Park,USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument</td>
			<td>BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC packing</td>
			<td>TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD</td>
			<td>0022818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRSA252</td>
			<td>USA, ATCC</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit</td>
			<td>DAKEWE, China</td>
			<td>8012011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR, Amplifier</td>
			<td>Thermal Cycler, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-target gene recombinant plasmid</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>B3528G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>G-CLONE, China</td>
			<td>CS1231-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>3120000844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>K400327-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera</td>
			<td>null</td>
			<td>See Reference 11 for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P4347-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Thermo Scientufuc, USA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF TRANSFER MEMBRANE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL,Japan</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Merck,Germany</td>
			<td>Tc-P8411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos L120C TEM</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB color solution</td>
			<td>TIAN GEN, China</td>
			<td>PA107-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turtle kits</td>
			<td>Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD</td>
			<td>ES80545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection

Nanoemulsionsadjuvansvacciner har väckt stor uppmärksamhet på grund av deras lilla partikelstorlek, höga termiska stabilitet och förmåga att inducera giltiga immunsvar. Det är dock viktigt att upprätta en serie omfattande protokoll för att utvärdera immunsvaret hos ett nytt nanoemulsionsadjuvansvaccin. Därför innehåller denna artikel ett rigoröst förfarande för att bestämma de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos ett vaccin (genom transmissionselektronmikroskopi [TEM], atomkraftmikroskopi [AFM] och dynamisk ljusspridning [DLS]), stabiliteten hos vaccinantigenet och systemet (genom ett höghastighetscentrifugtest, ett termodynamiskt stabilitetstest, SDS-PAGE och western blot) och det specifika immunsvaret (IgG1, IgG2a och IgG2b). Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan forskare noggrant utvärdera den skyddande effekten av ett nytt nanoemulsionsadjuvansvaccin i en dödlig MRSA252 musmodell. Med dessa protokoll kan det mest lovande nanoemulsionsvaccinadjuvansen när det gäller effektiv adjuvanspotential identifieras. Dessutom kan metoderna hjälpa till att optimera nya vacciner för framtida utveckling.

Protokollet för beredning av nanoemulsionsadjuvansvaccinet och in vitro- och in vivo-tester av detta vaccin utvärderades. TEM, AFM och DLS användes för att bestämma de viktiga egenskaperna hos zetapotentialen och partikelstorleken på ytan av detta prov (figur 1). SDS-PAGE och western blotting visade att mängden antigen i fällningen och supernatanten inte signifikant försämrades efter centrifugering, vilket indikerade att vaccinet var strukturellt intakt, specifikt...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection at JoVE.com

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection

Detta protokoll förbereder och utvärderar de fysikaliska egenskaperna, immunsvaret och in vivo-skyddande effekten av ett nytt nanoemulsionsadjuvansvaccin.

Utvärdering av immunsvaret hos ett nanoemulsionsadjuvansvaccin mot meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) -infektion

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

Det demonstrerade protokollet underströk det direkta och effektiva experimentella tillvägagångssättet och de detaljerade stegen för immunsvarseffekter av nya virala adjuvanser. Detta protokoll ger forskningen inte bara en grundläggande immunutvärderingsmetod för adjuvansvaccin utan kan också bestämma deras massstabilitet. Börja med att ta 10 milligram per milliliter arbetslösning av MRSA HI-antigenproteinet, och tillsätt sekventiellt de tre hjälpämnena, isopropylmyristat, polyoxietylenricinolja och propylenglykol, upprätthålla ett massförhållande på en är till sex är till tre.Rör om blandningen väl och tillsätt sedan gradvis steriliserat rent vatten för att nå en systemvolym på 10 ml. För att förbereda nanoemulsionsvaccinet med lågenergiemulgeringsmetod, rör om det vid 500 varv per minut och 25 grader Celsius i cirka 20 minuter. Därefter erhålles nanoemulsionsvaccinet innehållande ett milligram per milliliter protein som en klar transparent vätska.För antigenbeläggning av det enzymbundna immunosorbenttestet eller ELISA-plattan, späd HI-proteinantigenet till 10 mikrogram per ml med beläggningslösning och tillsätt 100 mikroliter av det utspädda antigenet per brunn i ELISA-plattan. Inkubera plattan vid fyra grader Celsius över natten. Tvätta plattan med 300 mikroliter PBST per brunn efter inkubation.Försegla brunnarna med 300 mikroliter tätningslösning per brunn i två timmar vid 37 grader Celsius, späd sedan tre mikroliter av mössserumet från varje experimentgrupp 100 gånger genom att tillsätta 297 mikroliter PBST och virvla det utspädda serumet. Tillsätt 100 mikroliter utspätt serum per brunn i den belagda ELISA-plattan för varje serumprov. Späd på liknande sätt de positiva och negativa kontrollserumen 100 gånger med PBST genom tillsats av fyra mikroliter positivt eller negativt kontrollserum till 396 mikroliter PBST, följt av virvelblandning.För att utföra utspädning med dubbelt förhållande, tillsätt 200 mikroliter av det tidigare utspädda experimentella serumet till den första raden av den belagda ELISA-plattan och tillsätt sedan 100 mikroliter PBST till alla brunnar, utom de i raderna ett och 12. Justera sedan pipettpistolen till 100 mikroliter och överför 100 mikroliter serum från första raden till andra raden innehållande PBST. Blanda innehållet i andra raden 10 gånger med pipettpistolen.På liknande sätt utför en är till två på varandra följande utspädningar av serumet till rad 11. När du är klar, kassera 100 mikroliter vätska från rad 11. Tillsätt 100 mikroliter utspätt negativt och positivt serum till varje motsvarande brunn på rad 12 enligt provmallen.Försegla ELISA-plattan med plastfolie och inkubera vid 37 grader Celsius i en timme. Under tiden späd sekundär antikropp anti-mus IgG HRP 10 000 gånger genom att tillsätta PBST. Efter en timmes inkubation, tvätta ELISA-plattan med 300 mikroliter PBST per brunn för att rengöra de obundna antikropparna, tillsätt sedan 100 mikroliter av den utspädda sekundära antikroppen till varje brunn och inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 40 minuter.Tvätta plattan med 300 mikroliter PBST per brunn och tillsätt sedan 100 mikroliter TMB-färgutvecklingslösning till varje brunn. Placera plattorna vid 37 grader Celsius och borta från ljus i 10 minuter. Därefter avslutas reaktionen omedelbart med 50 mikroliter av två molar svavelsyra.Detektera den optiska densiteten eller OD-värdena vid 415 nanometer med hjälp av en enzymmarkör inom 15 minuter efter avslutning. De fysikaliska egenskaperna hos det nya nanoemulsionsvaccinet analyserades med hjälp av transmissionselektronmikroskopi och atomkraftmikroskopi. Dynamisk ljusspridning användes för att bestämma partikelstorleksfördelningen och zetapotentialen hos provet.SDS-PAGE och western blotting visade att mängden antigen i fällningen och supernatanten inte signifikant fördröjdes efter centrifugering, vilket indikerar att vaccinet var strukturellt intakt, specifikt och immunogent. Adjuvansvaccinet mot nanoemulsion ökade signifikant de totala antikroppstitrarna IgG, IgG1 och IgG2a hos mössen. Proteinvaccinets immunogenicitet förbättrades signifikant.Serum IgG2b OD-värdena vid 450 nanometer var högst när PBS användes vid en en är till 5 000 utspädning. Den dödliga modellen av MRSA 252-möss återspeglade att nanoemulsionsvaccinet visade en god skyddande effekt och effektivt hämmade bakteriell infektion med MRS A 252, vilket förbättrade överlevnadsgraden hos infekterade möss. Beredningen av nanoemulgering och tillsats av serum till växten är de viktigaste.Också, där detektering antikroppstitern, bör man vara uppmärksam på att korrigera till en bredare och vätskebaserad ut. Förutom adjuvans kan denna metod också användas för immunutveckling av andra matematiska matriser, såsom plast eller leveranssystem.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Användning av Drip Flow och roterande reaktorer Disk för Staphylococcus aureus Biofilm Analys

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subkutan Infektion med meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

En introduktion till parasitsteklar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Och Antiparasite immunsvar

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimentell Endokardit Modell av Meticillinresistenta<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) i råtta

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kvantitativ mätning av immunsvaret och sova i<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Tillväxt med humant hemoglobin som järnkälla

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR-analys f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypning av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; vid Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metodik för studier av horisontell genöverföring i<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...