Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنح 81903189 و 82073418) ومؤسسة العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم المنحة 202102020025).

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى الأمراض الجلدية ، الجامعة الطبية الجنوبية (2020081). تم الحصول على موافقة المريض المستنيرة قبل جمع الأنسجة من الأفراد.
1. التحضير
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراءات التالية في بيئة معقمة تحت خزا?...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

يعد الحصول على الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة أساسا حاسما لمزيد من البحث. حتى الآن ، كانت هناك طريقتان للحصول على الخلايا الليفية الأولية: هضم الإنزيم وزراعةالنباتات 11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين التق?...

الجدرة ، وهو مرض تكاثري ليفي ، يتجلى في النمو المستمر للويحات التي غالبا ما تغزو الجلد الطبيعي المحيط دون قيود ذاتية وتسبب درجات مختلفة من الحكة والألم والأعباء التجميلية والنفسية للمرضى1. تلعب الخلايا الليفية ، وهي الخلايا الأولية المشاركة في الجدرة ، دورا أساسيا في تكوين هذا المرض وتطوره من خلال الانتشار المفرط ، وإنتاج المصفوفة الزائدة خارج الخلية ، والكولاجين غير المنظم2،3. ومع ذلك ، لا يزال التسبب في المرض الأساسي غير واضح ، ولا تزال هناك طريقة علاجية فعالة للجدرة ؛ لذلك ، هناك حاجة ملحة لمزيد من البحث 4,5.
نظرا لعدم وجود نموذج حيواني مثالي لأبحاث الجدرة في الجسم الحي 6،7 ، فإن بناء نموذج في المختبر عن طريق الحصول على الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة يمكن أن يوفر جدوى وموثوقية لأبحاث الجدرة 2,6. الخلايا الأولية هي تلك المشتقة مباشرة من الأنسجة الحية ، ومن المسلم به عموما أن هذه الخلايا يمكن أن تشبه إلى حد كبير الحالة الفسيولوجية والخلفية الوراثية للعديد من الأفراد مقارنة بخطوط الخلايا 8,9. توفر زراعة الخلايا الأولية وسيلة قوية لدراسة نمو الخلايا واستقلابها ، بالإضافة إلى الأنماط الظاهرية الأخرى للخلايا.
في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان للحصول على الخلايا الليفية الأولية: هضم الإنزيم وثقافة الزرع. ومع ذلك ، فقد تم تحديد العديد من العقبات التي تحول دون الحصول على الخلايا الليفية الأولية ، مثل خطر التلوث بالبكتيريا أو الفطريات المختلفة ، والاختلاط مع أنواع أخرى من الخلايا التي لا يمكن إزالتها بسهولة ، والفترة الطويلة لدورة الاستزراع ، والتغييرات اللاحقة في خصائص الخلية مقارنة بالخلايا الأصلية ، وما إلى ذلك9. لذلك ، فإن تطوير عملية مجدية وفعالة للحصول على الخلايا الليفية الأولية هو الأساس لمزيد من الدراسات والتطبيقات. تصف هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لاستخراج الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة التي يمكن أن توفر خلايا ليفية نقية وقابلة للحياة بشكل فعال ومطرد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

تلعب الخلايا الليفية، وهي نوع الخلية الرئيسي في أنسجة الجدرة، دورا أساسيا في تكوين الجدرة وتطورها. إن عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية المشتقة من أنسجة الجدرة هي الأساس لمزيد من الدراسات حول الوظيفة البيولوجية والآليات الجزيئية للجدرة ، بالإضافة إلى استراتيجيات علاجية جديدة لعلاجها. الطريقة التقليدية للحصول على الخلايا الليفية الأولية لها قيود ، مثل الحالة الخلوية السيئة ، والاختلاط مع أنواع أخرى من الخلايا ، والتعرض للتلوث. تصف هذه الورقة بروتوكولا محسنا وقابلا للتكرار بسهولة يمكن أن يقلل من حدوث المشكلات المحتملة عند الحصول على الخلايا الليفية. في هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة الخلايا الليفية بعد 5 أيام من العزلة وتصل إلى ما يقرب من 80٪ التقاء بعد 10 أيام من الثقافة. بعد ذلك ، يتم تمرير الخلايا الليفية والتحقق منها باستخدام الأجسام المضادة PDGFRα و vimentin لمقايسات التألق المناعي والأجسام المضادة CD90 لقياس التدفق الخلوي. في الختام ، يمكن الحصول بسهولة على الخلايا الليفية من أنسجة الجدرة من خلال هذا البروتوكول ، والذي يمكن أن يوفر مصدرا وفيرا ومستقرا للخلايا في المختبر لأبحاث الجدرة.

يتم تلخيص الجدول الزمني للبروتوكول في الشكل 1A. يتم عرض بعض الصور التمثيلية لعملية العزل في الشكل 2 ؛ تمت إزالة طبقات البشرة والطبقات الدهنية بعناية ، وتم فصل طبقة الجلد إلى أجزاء صغيرة من 3-4 مم2 ، والتي تم تلقيحها في أطباق بتري.
كما هو موض...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

تصف هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لإنشاء الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجدرة التي يمكن أن توفر خلايا ليفية نقية وقابلة للحياة بشكل فعال ومطرد.

عزل وثقافة وتوصيف الخلايا الليفية الجلدية الأولية من أنسجة الجدرة البشرية

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

إن عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية المشتقة من أنسجة الجدرة هي الأساس لمزيد من الدراسات على الجدرة. يمكن الحصول على الخلايا الليفية من أنسجة الجدرة بسهولة من خلال هذا البروتوكول ، والذي يمكن أن يوفر مصدرا وفيرا ومستقرا للخلايا في المختبر لأبحاث الجدرة. ابدأ باستخدام ملاقط معقمة لوضع أنسجة الجدرة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 إلى 25 ملليلتر من PBS مكمل ب 1٪ PSA.وفي الوقت نفسه ، أضف أربعة ملليلتر من محلول PBS PSA إلى كل بئر من صفيحة من ستة آبار. الآن أخرج المنديل من الأنبوب ، واغسله مرتين بمحلول PBS PSA. باستخدام زوج من الملقط المعقم ، انقل الأنسجة بالتتابع من بئر إلى آخر.ثم قم بإزالة الطبقات الدهنية والبشرة بالمقص الجراحي ، وترك الأدمة دون مساس. استخدم مقصا لتشريح الأدمة المشذبة إلى قطع من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات مربعة ونقل القطع إلى البئر التالي باستخدام ملقط معقم. اغسل القطع في محلول PBS PSA.باستخدام ملقط معقم ، ضع 10 إلى 30 قطعة من أنسجة الأدمة متباعدة أقل من خمسة ملليمترات في أطباق بتري. ضع الأطباق رأسا على عقب في حاضنة حتى تجف القطع وتلتصق بالطبق. بعد ذلك ، أضف سبعة ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ PSA ، واحتضان الأطباق كما كان من قبل.بعد ثلاثة أيام ، استبدل نصف المادة الطافية بوسط استزراع كامل. راقب الخلايا الليفية يوميا تحت التكبير المجهري 40X. قم بإزالة قطع الأنسجة في وسط المزرعة عندما تصل الخلايا الليفية إلى التقاء 90٪.اغسل الخلايا الليفية في برنامج تلفزيوني وأضف ملليلتر من محلول التربسين المعقم EDTA. بعد احتضان الخلايا في حاضنة رطبة ، اضغط برفق على طبق الثقافة وراقبه تحت المجهر. أضف ملليلتر من الوسط الكامل إلى نهاية عملية الهضم بمجرد انفصال معظم الخلايا.الآن نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم 15 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 300G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط كامل. زرع الخلايا الليفية في طبق زراعة الخلايا تسعة سنتيمترات واحتضانها في حاضنة مرطبة.لإجراء تحليل الفلورسنت المناعي بعد زراعة الخلايا الليفية على أغطية مستديرة واحتضانها في الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، أضف 50 ميكرولترا من محلول DAPI إلى الشريحة الزجاجية لتلطيخ النوى الخلوية. ضع أغطية الأغطية المغسولة على شرائح زجاجية باستخدام ملقط. أخيرا ، انقل العينات إلى صندوق مظلم مبلل للفحص المجهري الفلوري.لوحظت نمو الخلايا الليفية للأنسجة في خمسة أيام بعد المعالجة. أظهرت الخلايا الليفية معدلات انتشار عالية ووصلت إلى نقطة التقاء بعد 10 أيام. كانت الخلايا الليفية تحتوي على أجسام خلوية ممدودة وشبيهة بالمغزل ، والتي تمت محاذاتها في حزم عند التقاء عالي.عاد تلطيخ المناعي المناعي تألقا مناعيا أحمر إيجابيا للخلايا الليفية وتألقا مناعيا أزرق للنواة الخلوية. أظهرت مقايسات التدفق الخلوي إيجابية CD90 في جميع الخلايا الليفية تقريبا. وصفت هذه الدراسة طريقة محسنة وقدمت تعليمات واضحة لحل التحديات الحالية وزيادة فرصة النجاح لعزل وثقافة الخلايا الليفية الجدرة.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

الجيل التجريبية للسرطان ، المرتبطين بها الخلايا الليفية (مقاهي) من الخلايا الليفية الثديية البشرية

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

الجلد لكمة خزعة الثقافة ازدراع لاشتقاق الخلايا الليفية الإنسان الابتدائية

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

استخدام الخلايا الليفية الإنسان الأساسية لرصد نمط ظاهري الميتوكوندريا في مجال مرض باركنسون

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

ثقافة الأنسجة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الابتدائية نخاع العظم الإنسان والأورام الخبيثة في

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

الثقافة الأولية من الإنسان الدهليزي Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...