Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 81903189 en 82073418) en de Science and Technology Foundation of Guangzhou (subsidienummer 202102020025).

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele review board van het Dermatology Hospital, Southern Medical University (2020081). Geïnformeerde toestemming van de patiënt werd verkregen voordat weefsels van de individuen werden verzameld.
1. Voorbereiding
OPMERKING: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving onder een biologische veiligheidskast.
<ol><li>Bereid het volledige kweekmedium door 10% foetaal runderse...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

Het verkrijgen van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels is een kritische basis voor verder onderzoek. Tot nu toe waren er twee methoden voor het verkrijgen van primaire fibroblasten: enzymvertering en explantatiecultuur11,12,13,14. Beide traditionele methoden hebben echter beperkingen, zoals gevoeligheid voor besmetting, menging met andere soorten cellen, een lange kweekperiode en een la...

Keloïde, een fibroproliferatieve ziekte, manifesteert zich als de continue groei van plaques die vaak de omliggende normale huid binnendringen zonder zelfbeperking en verschillende gradaties van jeuk, pijn en cosmetische en psychologische lasten voor patiënten veroorzaken1. Fibroblasten, de primaire cellen die betrokken zijn bij keloïden, spelen een essentiële rol bij de vorming en ontwikkeling van deze ziekte door overmatige proliferatie, redundante extracellulaire matrixproductie en ongeorganiseerd collageen 2,3. De onderliggende pathogenese blijft echter onduidelijk en een effectieve therapeutische methode voor keloïde ontbreekt nog steeds; Daarom is er dringend behoefte aan verder onderzoek 4,5.
Aangezien er geen ideaal diermodel is voor keloïde onderzoek in vivo 6,7, kan het bouwen van een in vitro model door het verkrijgen van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels haalbaarheid en betrouwbaarheid bieden voor keloïde onderzoek 2,6. Primaire cellen zijn cellen die rechtstreeks afkomstig zijn van levend weefsel, en het wordt algemeen erkend dat deze cellen meer kunnen lijken op de fysiologische toestand en genetische achtergrond van meerdere individuen in vergelijking met cellijnen 8,9. Het kweken van primaire cellen biedt een krachtig middel om de groei en het metabolisme van cellen te bestuderen, evenals andere celfenotypen.
Op dit moment zijn er twee methoden voor het verkrijgen van primaire fibroblasten: enzymvertering en explantcultuur. Er zijn echter verschillende obstakels geïdentificeerd voor het verkrijgen van primaire fibroblasten, zoals het risico van besmetting door verschillende bacteriën of schimmels, vermenging met andere soorten cellen die niet gemakkelijk kunnen worden verwijderd, de lange periode van de kweekcyclus, de daaropvolgende veranderingen in de celkenmerken in vergelijking met de oorspronkelijke cellen, enzovoort9. Daarom is het ontwikkelen van een haalbaar en effectief proces voor het verkrijgen van primaire fibroblasten de basis voor verdere studies en toepassingen. Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor het extraheren van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels die effectief en gestaag zuivere en levensvatbare fibroblasten kunnen leveren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

Fibroblasten, het belangrijkste celtype in keloïde weefsel, spelen een essentiële rol bij de vorming en ontwikkeling van keloïden. De isolatie en kweek van primaire fibroblasten afgeleid van keloïde weefsel vormen de basis voor verdere studies van de biologische functie en moleculaire mechanismen van keloïden, evenals nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling ervan. De traditionele methode voor het verkrijgen van primaire fibroblasten heeft beperkingen, zoals een slechte cellulaire toestand, menging met andere soorten cellen en gevoeligheid voor besmetting. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd en gemakkelijk reproduceerbaar protocol dat het optreden van mogelijke problemen bij het verkrijgen van fibroblasten zou kunnen verminderen. In dit protocol kunnen fibroblasten 5 dagen na isolatie worden waargenomen en bijna 80% confluentie bereiken na 10 dagen cultuur. Vervolgens worden de fibroblasten gepasseerd en geverifieerd met behulp van PDGFRα- en vimentine-antilichamen voor immunofluorescentietests en CD90-antilichamen voor flowcytometrie. Kortom, fibroblasten uit keloïde weefsel kunnen gemakkelijk worden verkregen via dit protocol, dat een overvloedige en stabiele bron van cellen in het laboratorium kan bieden voor keloïde onderzoek.

De tijdlijn van het protocol is samengevat in figuur 1A. Enkele representatieve beelden van het isolatieproces zijn weergegeven in figuur 2; de epidermis- en vetlagen werden zorgvuldig verwijderd en de dermislaag werd gescheiden in kleine fragmenten van 3-4 mm2, die in de petrischalen werden ingeënt.
Zoals te zien is in figuur 3A, werden 5 dagen na verwerking verschillende fibroblastuitwas...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor het vaststellen van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels die effectief en gestaag zuivere en levensvatbare fibroblasten kunnen leveren.

Isolatie, cultuur en karakterisering van primaire dermale fibroblasten uit menselijk keloïde weefsel

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

De isolatie en kweek van primaire fibroblasten afgeleid van keloïde weefsel vormen de basis voor verdere studies van keloïden. Fibroblasten uit keloïde weefsel kunnen gemakkelijk worden verkregen via dit protocol, dat een overvloedige en stabiele bron van cellen in het laboratorium kan bieden voor keloïde onderzoek. Begin met het gebruik van een steriel pincet om het keloïde weefsel in een steriele centrifugebuis van 50 milliliter te plaatsen met 10 tot 25 milliliter PBS aangevuld met 1% PSA.Voeg ondertussen vier milliliter PBS PSA-oplossing toe aan elke put van een plaat met zes putten. Haal nu het weefsel uit de buis en was twee keer met PBS PSA-oplossing. Breng met behulp van een steriele tang het weefsel sequentieel over van de ene put naar de volgende.Verwijder vervolgens de vet- en epidermislagen met een chirurgische schaar en laat de dermis onaangeroerd. Gebruik een schaar om de bijgesneden dermis in stukken van drie tot vijf vierkante millimeter te ontleden en breng de stukken over naar de volgende put met een steriele tang. Was de stukken in PBS PSA-oplossing.Plaats met behulp van een gesteriliseerde tang 10 tot 30 stukjes dermisweefsel op minder dan vijf millimeter afstand van elkaar in petrischalen. Leg de gerechten ondersteboven in een couveuse tot de stukjes droog zijn en aan de schaal blijven plakken. Voeg vervolgens zeven milliliter DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% PSA toe en incuber de gerechten zoals voorheen.Vervang na drie dagen de helft van het supernatant door een compleet kweekmedium. Observeer de fibroblasten dagelijks onder 40x microscopische vergroting. Verwijder de weefselstukken in het kweekmedium wanneer de fibroblasten 90% samenvloeiing bereiken.Was de fibroblasten in PBS en voeg twee milliliter steriele trypsine EDTA-oplossing toe. Nadat u de cellen in een bevochtigde incubator hebt geïncubeerd, tikt u voorzichtig op de kweekschaal en observeert u deze onder de microscoop. Voeg twee milliliter volledig medium toe om de spijsvertering te beëindigen zodra de meeste cellen zijn losgemaakt.Breng nu de celsuspensie over naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer de buis gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op 300 G. Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspensie van de celkorrel in volledig medium. Zaai de fibroblasten in een celkweekschaal van negen centimeter en incubeer in een bevochtigde incubator.Om immunofluorescente analyse uit te voeren na het kweken van de fibroblasten op ronde coverslips en ze te incuberen in primaire en secundaire antilichamen, voegt u 50 microliter DAPI-oplossing toe aan de glasplaat om de celkernen te kleuren. Plaats de gewassen coverslips op glazen platen met behulp van een tang. Breng ten slotte de monsters over naar een natte donkere doos voor fluorescerende microscopie.Fibroblastuitwassen van het weefsel werden waargenomen vijf dagen na verwerking. De fibroblasten vertoonden hoge proliferatiesnelheden en bereikten confluentie na 10 dagen. De fibroblasten hadden langwerpige en spindelachtige cellichamen, die in bundels bij hoge samenvloeiing waren uitgelijnd.Immunofluorescente kleuring retourneerde positieve rode immunofluorescentie van de fibroblasten en blauwe immunofluorescentie van de cellulaire kern. Flowcytometrische assays toonden CD90-positiviteit in bijna alle fibroblasten. Deze studie heeft een geoptimaliseerde methode beschreven en duidelijke instructies gegeven om bestaande uitdagingen op te lossen en de kans op succes voor de isolatie en cultuur van keloïde fibroblasten te vergroten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van Human Borst fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Huid Punch Biopsie Explantatiestatus Cultuur voor Afleiding van primaire humane fibroblasten

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primaire cultuur van de mens Vestibular Schwannomen

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...