Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 81903189 et 82073418) et de la Fondation pour la science et la technologie de Guangzhou (numéro de subvention 202102020025).

Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’hôpital de dermatologie de la Southern Medical University (2020081). Le consentement éclairé du patient a été obtenu avant que les tissus ne soient prélevés sur les individus.
1. Préparation
REMARQUE : Les procédures suivantes doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une enceinte de sécurité biologique.
<ol><li>Préparer un milieu de cul...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

L’obtention de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes est une base essentielle pour la poursuite des recherches. Jusqu’à présent, il existait deux méthodes d’acquisition de fibroblastes primaires: la digestion enzymatique et la culture d’explant11,12,13,14. Cependant, les deux méthodes traditionnelles ont des limites, telles que la susceptibilité à la contamination...

Chéloïde, une maladie fibroproliférative, se manifeste par la croissance continue de plaques qui envahissent souvent la peau normale environnante sans autolimitation et provoquent divers degrés de démangeaisons, de douleurs et de fardeaux cosmétiques et psychologiques pour les patients1. Les fibroblastes, les cellules primaires impliquées dans les chéloïdes, jouent un rôle essentiel dans la formation et le développement de cette maladie par une prolifération excessive, une production redondante de matrice extracellulaire et des collagènes désorganisés 2,3. Cependant, la pathogenèse sous-jacente reste floue et il manque encore une méthode thérapeutique efficace pour la chéloïde; Par conséquent, il est urgent de poursuivre les recherches 4,5.
Comme il n’existe pas de modèle animal idéal pour la recherche chéloïde in vivo 6,7, la construction d’un modèle in vitro par l’acquisition de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes peut offrir faisabilité et fiabilité pour la recherche chéloïde 2,6. Les cellules primaires sont celles qui proviennent directement de tissus vivants, et il est généralement reconnu que ces cellules peuvent ressembler davantage à l’état physiologique et au bagage génétique de plusieurs individus que les lignées cellulaires 8,9. La culture de cellules primaires fournit un moyen puissant d’étudier la croissance et le métabolisme des cellules, ainsi que d’autres phénotypes cellulaires.
À l’heure actuelle, il existe deux méthodes d’acquisition de fibroblastes primaires: la digestion enzymatique et la culture d’explant. Cependant, plusieurs obstacles ont été identifiés à l’obtention de fibroblastes primaires, tels que le risque de contamination par diverses bactéries ou champignons, le mélange avec d’autres types de cellules qui ne sont pas facilement éliminées, la longue période du cycle de culture, les modifications ultérieures des caractéristiques cellulaires par rapport aux cellules d’origine, etc.9. Par conséquent, le développement d’un processus réalisable et efficace pour obtenir des fibroblastes primaires est la base d’études et d’applications ultérieures. Cette étude décrit un protocole optimisé pour extraire les fibroblastes primaires des tissus chéloïdes qui peuvent fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

Les fibroblastes, le principal type cellulaire dans le tissu chéloïde, jouent un rôle essentiel dans la formation et le développement des chéloïdes. L’isolement et la culture de fibroblastes primaires dérivés de tissus chéloïdes sont à la base d’études plus approfondies de la fonction biologique et des mécanismes moléculaires des chéloïdes, ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les traiter. La méthode traditionnelle d’obtention de fibroblastes primaires présente des limites, telles qu’un mauvais état cellulaire, le mélange avec d’autres types de cellules et la susceptibilité à la contamination. Cet article décrit un protocole optimisé et facilement reproductible qui pourrait réduire l’apparition de problèmes possibles lors de l’obtention de fibroblastes. Dans ce protocole, les fibroblastes peuvent être observés 5 jours après l’isolement et atteignent près de 80% de confluence après 10 jours de culture. Ensuite, les fibroblastes sont passés et vérifiés à l’aide d’anticorps PDGFRα et vimentine pour les tests d’immunofluorescence et d’anticorps CD90 pour la cytométrie en flux. En conclusion, les fibroblastes du tissu chéloïde peuvent être facilement acquis grâce à ce protocole, ce qui peut fournir une source abondante et stable de cellules dans le laboratoire pour la recherche chéloïde.

La chronologie du protocole est résumée à la figure 1A. Quelques images représentatives du processus d’isolement sont présentées à la figure 2; L’épiderme et les couches adipeuses ont été soigneusement enlevés et la couche dermique a été séparée en petits fragments de 3-4 mm2, qui ont été inoculés dans les boîtes de Pétri.
Comme le montre la figure 3A, plusieurs excr...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Cette étude décrit un protocole optimisé pour établir des fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes capables de fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.

Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

L’isolement et la culture de fibroblastes primaires dérivés de tissus chéloïdes sont la base d’autres études sur les chéloïdes. Les fibroblastes du tissu chéloïde peuvent être facilement acquis grâce à ce protocole, qui peut fournir une source abondante et stable de cellules dans le laboratoire pour la recherche chéloïde. Commencez par utiliser une pince à épiler stérile pour placer le tissu chéloïde dans un tube centrifuge stérile de 50 millilitres contenant 10 à 25 millilitres de PBS complété par 1% de PSA.Pendant ce temps, ajoutez quatre millilitres de solution PBS PSA à chaque puits d’une plaque de six puits. Maintenant, retirez le mouchoir du tube et lavez deux fois avec une solution de PBS PSA. À l’aide d’une paire de pinces stériles, transférez le tissu séquentiellement d’un puits à l’autre.Ensuite, retirez les couches adipeuses et épidermiques avec des ciseaux chirurgicaux, laissant le derme intact. Utilisez une paire de ciseaux pour disséquer le derme taillé en morceaux de trois à cinq millimètres carrés et transférez les morceaux au puits suivant avec une paire de pinces stériles. Lavez les morceaux dans une solution PBS PSA.À l’aide de pinces stérilisées, placer 10 à 30 morceaux de tissu dermique espacés de moins de cinq millimètres dans des boîtes de Pétri. Placez les plats à l’envers dans un incubateur jusqu’à ce que les morceaux sèchent et collent au plat. Ensuite, ajoutez sept millilitres de DMEM complétés par 10% FBS et 1% PSA, et incuber les plats comme avant.Après trois jours, remplacer la moitié du surnageant par un milieu de culture complet. Observez les fibroblastes quotidiennement sous un grossissement microscopique de 40X. Retirez les morceaux de tissu dans le milieu de culture lorsque les fibroblastes atteignent 90% de confluence.Lavez les fibroblastes dans du PBS et ajoutez deux millilitres de solution stérile de trypsine EDTA. Après avoir incubé les cellules dans un incubateur humidifié, tapotez doucement le plat de culture et observez-le au microscope. Ajouter deux millilitres de milieu complet pour terminer la digestion une fois que la plupart des cellules se sont détachées.Maintenant, transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres et centrifugez le tube à 300G pendant trois minutes à température ambiante. Jeter soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu complet. Ensemencez les fibroblastes dans une boîte de culture cellulaire de neuf centimètres et incuber dans un incubateur humidifié.Pour effectuer une analyse immunofluorescente après avoir cultivé les fibroblastes sur des lamelles de couverture rondes et les avoir incubés dans des anticorps primaires et secondaires, ajoutez 50 microlitres de solution DAPI à la lame de verre pour colorer les noyaux cellulaires. Placez les lames de couverture lavées sur des lames de verre à l’aide de pinces. Enfin, transférez les échantillons dans une boîte sombre humide pour la microscopie fluorescente.Des excroissances de fibroblastes du tissu ont été observées cinq jours après le traitement. Les fibroblastes ont affiché des taux de prolifération élevés et ont atteint la confluence après 10 jours. Les fibroblastes avaient des corps cellulaires allongés et fusiformes, qui étaient alignés en faisceaux à forte confluence.La coloration immunofluorescente a renvoyé une immunofluorescence rouge positive des fibroblastes et une immunofluorescence bleue du noyau cellulaire. Les tests de cytométrie en flux ont montré une positivité de CD90 dans presque tous les fibroblastes. Cette étude a décrit une méthode optimisée et fourni des instructions claires pour résoudre les défis existants et augmenter les chances de succès pour l’isolement et la culture des fibroblastes chéloïdes.

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