Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Fördernummern 81903189 und 82073418) und der Science and Technology Foundation of Guangzhou (Fördernummer 202102020025) unterstützt.

Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des Dermatologischen Krankenhauses der Southern Medical University (2020081) genehmigt. Die informierte Einwilligung der Patienten wurde eingeholt, bevor Gewebe von den Personen entnommen wurde.
1. Vorbereitung
HINWEIS: Die folgenden Verfahren sollten in einer sterilen Umgebung unter einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie ein vollständiges Nährm...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

Die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe ist eine wichtige Grundlage für die weitere Forschung. Bisher gab es zwei Methoden zur Gewinnung primärer Fibroblasten: Enzymverdau und Explantatkultur11,12,13,14. Beide traditionellen Methoden haben jedoch Einschränkungen, wie z. B. die Anfälligkeit für Kontamination, die Vermischung mit anderen Zelltypen, eine lange Kulturzeit und...

Keloid, eine fibroproliferative Erkrankung, manifestiert sich durch das kontinuierliche Wachstum von Plaques, die oft ohne Selbstbeschränkung in die umgebende normale Haut eindringen und bei den Patienten verschiedene Grade von Juckreiz, Schmerzen sowie kosmetischen und psychischen Belastungen verursachen1. Fibroblasten, die primären Zellen, die an Keloiden beteiligt sind, spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Entwicklung dieser Krankheit durch übermäßige Proliferation, redundante extrazelluläre Matrixproduktion und desorganisierte Kollagene 2,3. Die zugrundeliegende Pathogenese ist jedoch noch unklar, und es fehlt noch an einer wirksamen therapeutischen Methode für Keloide; Daher besteht dringender Bedarf an weiterer Forschung 4,5.
Da es kein ideales Tiermodell für die Keloidforschung in vivo gibt 6,7, kann der Aufbau eines In-vitro-Modells durch die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben die Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit für die Keloidforschung bieten 2,6. Primärzellen sind solche, die direkt aus lebendem Gewebe stammen, und es ist allgemein anerkannt, dass diese Zellen dem physiologischen Zustand und dem genetischen Hintergrund mehrerer Individuen im Vergleich zu Zelllinien ähnlicher sein können 8,9. Die Kultivierung von Primärzellen bietet ein leistungsfähiges Mittel, um das Wachstum und den Stoffwechsel von Zellen sowie andere Zellphänotypen zu untersuchen.
Derzeit gibt es zwei Methoden zur Gewinnung von primären Fibroblasten: den Enzymverdau und die Explantatkultur. Es wurden jedoch mehrere Hindernisse für die Gewinnung von primären Fibroblasten identifiziert, wie z. B. das Risiko einer Kontamination durch verschiedene Bakterien oder Pilze, die Vermischung mit anderen Zelltypen, die nicht leicht zu entfernen sind, die lange Dauer des Kulturzyklus, die anschließenden Veränderungen der Zelleigenschaften im Vergleich zu den ursprünglichen Zellen usw. 9. Daher ist die Entwicklung eines praktikablen und effektiven Verfahrens zur Gewinnung primärer Fibroblasten die Grundlage für weitere Studien und Anwendungen. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Extraktion von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, das effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

Fibroblasten, der wichtigste Zelltyp im Keloidgewebe, spielen eine wesentliche Rolle bei der Bildung und Entwicklung von Keloiden. Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen der biologischen Funktion und der molekularen Mechanismen von Keloiden sowie für neue therapeutische Strategien zu ihrer Behandlung. Die traditionelle Methode zur Gewinnung primärer Fibroblasten hat Einschränkungen, wie z. B. einen schlechten Zellzustand, eine Vermischung mit anderen Zelltypen und eine Anfälligkeit für Kontamination. In diesem Artikel wird ein optimiertes und leicht reproduzierbares Protokoll beschrieben, das das Auftreten möglicher Probleme bei der Gewinnung von Fibroblasten reduzieren könnte. In diesem Protokoll können Fibroblasten 5 Tage nach der Isolierung beobachtet werden und erreichen nach 10 Tagen Kultur eine Konfluenz von fast 80 %. Anschließend werden die Fibroblasten mit PDGFRα- und Vimentin-Antikörpern für Immunfluoreszenz-Assays und CD90-Antikörpern für die Durchflusszytometrie verifiziert und verifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Fibroblasten aus Keloidgewebe durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden können, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann.

Der zeitliche Ablauf des Protokolls ist in Abbildung 1A zusammengefasst. Einige repräsentative Bilder des Isolationsprozesses sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Epidermis- und Fettschichten wurden vorsichtig entfernt, und die Dermisschicht wurde in kleine Fragmente von 3-4 mm2 getrennt, die in die Petrischalen inokuliert wurden.
Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurden 5 Tage nach der Verarbe...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen von Keloiden. Fibroblasten aus Keloidgewebe können durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann. Beginnen Sie mit einer sterilen Pinzette, um das Keloidgewebe in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu geben, das 10 bis 25 Milliliter PBS enthält, das mit 1 % PSA angereichert ist.In der Zwischenzeit fügen Sie vier Milliliter PBS-PSA-Lösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu. Nehmen Sie nun das Gewebe aus der Tube und waschen Sie es zweimal mit PBS-PSA-Lösung. Übertragen Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette nacheinander von einer Vertiefung in die nächste.Entfernen Sie dann die Fett- und Epidermisschichten mit einer chirurgischen Schere, wobei die Dermis unberührt bleibt. Verwenden Sie eine Schere, um die getrimmte Dermis in drei bis fünf Quadratmillimeter große Stücke zu zerlegen und die Stücke mit einer sterilen Pinzette in die nächste Vertiefung zu übertragen. Waschen Sie die Stücke in PBS PSA-Lösung.Legen Sie mit einer sterilisierten Pinzette 10 bis 30 Dermisgewebestücke mit einem Abstand von weniger als fünf Millimetern in Petrischalen. Stellen Sie die Schalen kopfüber in einen Inkubator, bis die Stücke trocken sind und an der Schale kleben. Als nächstes fügen Sie sieben Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSA, und inkubieren Sie die Schalen wie zuvor.Nach drei Tagen wird die Hälfte des Überstandes durch ein vollständiges Nährmedium ersetzt. Beobachten Sie die Fibroblasten täglich unter 40-facher mikroskopischer Vergrößerung. Entfernen Sie die Gewebestücke im Kulturmedium, wenn die Fibroblasten eine Konfluenz von 90 % erreichen.Waschen Sie die Fibroblasten in PBS und fügen Sie zwei Milliliter sterile Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Nachdem Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator inkubiert haben, klopfen Sie vorsichtig auf die Kulturschale und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Fügen Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums hinzu, um die Verdauung zu beenden, sobald sich die meisten Zellen abgelöst haben.Füllen Sie nun die Zellsuspension in ein steriles 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen um und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet in vollständigem Medium. Säen Sie die Fibroblasten in eine neun Zentimeter große Zellkulturschale und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator.Um eine Immunfluoreszenzanalyse durchzuführen, nachdem die Fibroblasten auf runden Deckgläsern kultiviert und in primären und sekundären Antikörpern inkubiert wurden, geben Sie 50 Mikroliter DAPI-Lösung in den Objektträger, um die Zellkerne zu färben. Legen Sie die gewaschenen Deckgläser mit einer Pinzette auf Objektträger. Zum Schluss überführen Sie die Proben in eine feuchte Dunkelbox für die Fluoreszenzmikroskopie.Fibroblastenauswüchse des Gewebes wurden fünf Tage nach der Verarbeitung beobachtet. Die Fibroblasten zeigten hohe Proliferationsraten und erreichten nach 10 Tagen eine Konfluenz. Die Fibroblasten besaßen längliche und spindelartige Zellkörper, die in Bündeln mit hoher Konfluenz angeordnet waren.Die Immunfluoreszenzfärbung ergab eine positive rote Immunfluoreszenz der Fibroblasten und eine blaue Immunfluoreszenz des Zellkerns. Durchflusszytometrische Assays zeigten CD90-Positivität in fast allen Fibroblasten. Diese Studie hat eine optimierte Methode beschrieben und klare Anweisungen gegeben, um bestehende Herausforderungen zu lösen und die Erfolgschancen für die Isolierung und Kultur von Keloid-Fibroblasten zu erhöhen.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

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Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

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