Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 81903189 ו -82073418) וקרן המדע והטכנולוגיה של גואנגזו (מענק מספר 202102020025).

מחקר זה אושר על ידי ועדת הסקירה המוסדית של בית החולים לדרמטולוגיה, האוניברסיטה הרפואית הדרומית (2020081). הסכמה מדעת של המטופל התקבלה לפני איסוף הרקמות.
1. הכנה
הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים בסביבה סטרילית תחת ארון בטיחות ביולוגי.
<ol><li>הכינו מדיום תרבית ...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

השגת פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות היא בסיס קריטי למחקר נוסף. עד כה, היו שתי שיטות לרכישת פיברובלסטים ראשוניים: עיכול אנזימים ותרבית צמחים11,12,13,14. עם זאת, לשתי השיטות המסורתיות יש מגבלות, כגון רגישות לזיהום, ערב?...

קלואיד, מחלה פיברופרוליפרטיבית, מתבטאת בצמיחה מתמשכת של פלאקים שלעתים קרובות פולשים לעור הרגיל שמסביב ללא הגבלה עצמית וגורמים לדרגות שונות של גירוד, כאב ונטל קוסמטי ופסיכולוגי לחולים1. פיברובלסטים, התאים העיקריים המעורבים בקלואידים, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות ובהתפתחות של מחלה זו באמצעות התרבות יתר, ייצור מטריצות חוץ-תאיות מיותרות וקולגןלא מאורגן 2,3. עם זאת, הפתוגנזה הבסיסית נותרה לא ברורה, ושיטה טיפולית יעילה לקלואיד עדיין חסרה; לכן, יש צורך דחוף במחקר נוסף 4,5.
מכיוון שאין מודל אידיאלי בבעלי חיים למחקר קלואיד in vivo 6,7, בניית מודל במבחנה על ידי רכישת פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות יכולה להציע היתכנות ואמינות למחקר קלואיד 2,6. תאים ראשוניים הם אלה שמקורם ישירות ברקמה חיה, וידוע בדרך כלל כי תאים אלה יכולים להידמות יותר למצב הפיזיולוגי ולרקע הגנטי של אנשים רבים בהשוואה לשורות תאים 8,9. טיפוח תאים ראשוניים מספק אמצעי רב עוצמה לחקר הצמיחה והמטבוליזם של תאים, כמו גם פנוטיפים אחרים של תאים.
כיום, ישנן שתי שיטות לרכישת פיברובלסטים ראשוניים: עיכול אנזימים ותרבית צמחים. עם זאת, זוהו מספר מכשולים להשגת פיברובלסטים ראשוניים, כגון הסיכון לזיהום על ידי חיידקים או פטריות שונים, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים שאינם מוסרים בקלות, התקופה הארוכה של מחזור התרבית, השינויים הבאים במאפייני התא בהשוואה לתאים המקוריים, וכן הלאה9. לכן, פיתוח תהליך אפשרי ויעיל להשגת פיברובלסטים ראשוניים הוא הבסיס למחקרים ויישומים נוספים. מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לחילוץ פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

פיברובלסטים, סוג התא העיקרי ברקמת קלואיד, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות והתפתחות קלואידים. הבידוד והתרבית של פיברובלסטים ראשוניים שמקורם ברקמה קלואידית הם הבסיס למחקרים נוספים על הפונקציה הביולוגית והמנגנונים המולקולריים של קלואידים, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול בהם. לשיטה המסורתית להשגת פיברובלסטים ראשוניים יש מגבלות, כגון מצב תאי ירוד, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים ורגישות לזיהום. מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטב וקל לשחזור שיכול להפחית את התרחשותן של בעיות אפשריות בעת השגת פיברובלסטים. בפרוטוקול זה, ניתן לצפות בפיברובלסטים 5 ימים לאחר הבידוד ולהגיע לכמעט 80% מפגש לאחר 10 ימי תרבית. לאחר מכן, הפיברובלסטים עוברים ומאומתים באמצעות נוגדני PDGFRα ווימנטין לבדיקות אימונופלואורסנציה ונוגדני CD90 לציטומטריית זרימה. לסיכום, פיברובלסטים מרקמה קלואידית ניתן לרכוש בקלות באמצעות פרוטוקול זה, אשר יכול לספק מקור שופע ויציב של תאים במעבדה למחקר קלואיד.

ציר הזמן של הפרוטוקול מסוכם באיור 1A. כמה תמונות מייצגות של תהליך הבידוד מוצגות באיור 2; שכבות האפידרמיס והשומן הוסרו בקפידה, ושכבת הדרמיס הופרדו לשברים קטנים של 3-4 מ"מ2, שחוסנו לצלחות הפטרי.
כפי שניתן לראות באיור 3A, כמה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לביסוס פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

הבידוד והתרבית של פיברובלסטים ראשוניים שמקורם ברקמת קלואיד הם הבסיס למחקרים נוספים של קלואידים. פיברובלסטים מרקמה קלואידית ניתן לרכוש בקלות באמצעות פרוטוקול זה, אשר יכול לספק מקור שופע ויציב של תאים במעבדה למחקר קלואיד. התחל על ידי שימוש בפינצטה סטרילית כדי למקם את רקמת הקלואיד בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר המכיל 10 עד 25 מיליליטר של PBS בתוספת 1% PSA.בינתיים, הוסף ארבעה מיליליטר של תמיסת PBS PSA לכל באר של צלחת שש בארות. כעת הוציאו את הרקמה מהצינור, ושטפו פעמיים בתמיסת PBS PSA. באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, להעביר את הרקמה ברצף מבאר אחת לאחרת.לאחר מכן להסיר את שכבות השומן ואת האפידרמיס עם מספריים כירורגיים, משאיר את הדרמיס ללא פגע. השתמש בזוג מספריים כדי לנתח את הדרמיס החתוך לשלוש עד חמש חתיכות מילימטר מרובע ולהעביר את החתיכות לבאר הבאה עם זוג מלקחיים סטריליים. שטפו את החתיכות בתמיסת PBS PSA.בעזרת מלקחיים מעוקרים, הניחו בצלחות פטרי 10 עד 30 חתיכות רקמת דרמיס במרווחים של פחות מחמישה מילימטרים זו מזו. מניחים את הכלים הפוכים באינקובטור עד שהנתחים מתייבשים ונדבקים לצלחת. לאחר מכן, להוסיף שבעה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% PSA, ולדגור את הכלים כמו קודם.לאחר שלושה ימים, החליפו חצי מהסופרנאטנט במדיום תרבית שלם. יש להתבונן בפיברובלסטים מדי יום תחת הגדלה מיקרוסקופית פי 40. הסר את חתיכות הרקמה במדיום התרבית כאשר הפיברובלסטים מגיעים למפגש של 90%.שטפו את הפיברובלסטים ב-PBS והוסיפו שני מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA סטרילית. לאחר הדגירה על התאים באינקובטור לח, טפחו בעדינות על צלחת התרבית והתבוננו בה מתחת למיקרוסקופ. מוסיפים שני מיליליטר של מדיום שלם כדי לסיים את העיכול לאחר שרוב התאים התנתקו.כעת העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור ב-300G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות ולהשהות מחדש את כדורית התא בתווך מלא. זרעו את הפיברובלסטים בצלחת תרבית תאים בגודל תשעה סנטימטרים ודגרו באינקובטור לח.כדי לבצע אנליזה אימונופלואורסצנטית לאחר תרבית הפיברובלסטים על כיסויים עגולים ודגירתם בנוגדנים ראשוניים ומשניים, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למגלשת הזכוכית כדי להכתים את גרעיני התא. הניחו את הכיסויים השטופים על מגלשות זכוכית באמצעות מלקחיים. לבסוף, העבירו את הדגימות לקופסה כהה ורטובה למיקרוסקופ פלואורסצנטי.תולדות פיברובלסטים של הרקמה נצפו חמישה ימים לאחר העיבוד. הפיברובלסטים הפגינו שיעורי התפשטות גבוהים והגיעו למפגש לאחר 10 ימים. לפיברובלסטים היו גופי תאים מוארכים ודמויי ציר, שהיו מיושרים בצרורות במפגש גבוה.צביעה אימונופלואורסצנטית החזירה אימונופלואורסצנטיות אדומה חיובית של הפיברובלסטים ואימונופלואורסצנטיות כחולה של גרעין התא. בדיקות ציטומטריות של זרימה הראו חיוביות CD90 כמעט בכל הפיברובלסטים. מחקר זה תיאר שיטה אופטימלית וסיפק הוראות ברורות לפתרון אתגרים קיימים ולהגדלת סיכויי ההצלחה לבידוד ולתרבית של פיברובלסטים קלואידים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

תרבות explant עור אגרוף ביופסיה לגזירה של fibroblasts אדם היסודי

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...