Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 81903189 e 82073418) e della Science and Technology Foundation di Guangzhou (numero di sovvenzione 202102020025).

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del Dermatology Hospital, Southern Medical University (2020081). Il consenso informato del paziente è stato ottenuto prima che i tessuti fossero raccolti dagli individui.
1. Preparazione
NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in ambiente sterile sotto un armadio di sicurezza biologica.
<ol><li>Preparare un terreno di coltura completo aggiungendo il 10% di siero b...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

Ottenere fibroblasti primari dai tessuti cheloidi è una base fondamentale per ulteriori ricerche. Fino ad ora, ci sono stati due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianti11,12,13,14. Tuttavia, entrambi i metodi tradizionali hanno limiti, come la suscettibilità alla contaminazione, la miscelazione con altri tipi di cellule, un lungo periodo di coltur...

Il cheloide, una malattia fibroproliferativa, si manifesta come la crescita continua di placche che spesso invadono la pelle normale circostante senza autolimitazione e causano vari gradi di prurito, dolore e oneri estetici e psicologici per i pazienti1. I fibroblasti, le cellule primarie coinvolte nei cheloidi, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo di questa malattia attraverso un'eccessiva proliferazione, la produzione ridondante di matrice extracellulare e collageni disorganizzati 2,3. Tuttavia, la patogenesi sottostante rimane poco chiara e manca ancora un metodo terapeutico efficace per il cheloide; Pertanto, vi è un urgente bisogno di ulteriori ricerche 4,5.
Poiché non esiste un modello animale ideale per la ricerca sui cheloidi in vivo 6,7, la costruzione di un modello in vitro mediante l'acquisizione di fibroblasti primari da tessuti cheloidi può offrire fattibilità e affidabilità per la ricerca cheloide 2,6. Le cellule primarie sono quelle derivate direttamente da tessuti viventi ed è generalmente riconosciuto che queste cellule possono assomigliare più da vicino allo stato fisiologico e al background genetico di più individui rispetto alle linee cellulari 8,9. La coltura delle cellule primarie fornisce un potente mezzo per studiare la crescita e il metabolismo delle cellule, così come altri fenotipi cellulari.
Allo stato attuale, ci sono due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianto. Tuttavia, sono stati identificati diversi ostacoli all'ottenimento di fibroblasti primari, come il rischio di contaminazione da parte di vari batteri o funghi, la miscelazione con altri tipi di cellule che non sono facilmente rimosse, il lungo periodo del ciclo di coltura, le successive modifiche alle caratteristiche cellulari rispetto alle cellule originali e così via9. Pertanto, lo sviluppo di un processo fattibile ed efficace per ottenere fibroblasti primari è la base per ulteriori studi e applicazioni. Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per l'estrazione di fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

I fibroblasti, il principale tipo di cellula nel tessuto cheloide, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo dei cheloidi. L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sulla funzione biologica e sui meccanismi molecolari dei cheloidi, nonché nuove strategie terapeutiche per il loro trattamento. Il metodo tradizionale per ottenere fibroblasti primari ha dei limiti, come il cattivo stato cellulare, la miscelazione con altri tipi di cellule e la suscettibilità alla contaminazione. Questo documento descrive un protocollo ottimizzato e facilmente riproducibile che potrebbe ridurre l'insorgenza di possibili problemi quando si ottengono fibroblasti. In questo protocollo, i fibroblasti possono essere osservati 5 giorni dopo l'isolamento e raggiungere quasi l'80% di confluenza dopo 10 giorni di coltura. Quindi, i fibroblasti vengono fatti passare e verificati utilizzando anticorpi PDGFRα e vimentina per saggi di immunofluorescenza e anticorpi CD90 per citometria a flusso. In conclusione, i fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca sui cheloidi.

La sequenza temporale del protocollo è riassunta nella Figura 1A. Alcune immagini rappresentative del processo di isolamento sono mostrate nella Figura 2; l'epidermide e gli strati adiposi sono stati accuratamente rimossi e lo strato del derma è stato separato in piccoli frammenti di 3-4 mm2, che sono stati inoculati nelle piastre di Petri.
Come mostrato nella Figura 3A, diverse escrescen...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per stabilire fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sui cheloidi. I fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca cheloide. Iniziare utilizzando pinzette sterili per posizionare il tessuto cheloide in un tubo da centrifuga sterile da 50 millilitri contenente da 10 a 25 millilitri di PBS integrato con 1% PSA.Nel frattempo, aggiungere quattro millilitri di soluzione PSA PBS a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Ora estrarre il tessuto dal tubo e lavare due volte con la soluzione PBS PSA. Utilizzando un paio di pinze sterili, trasferire il tessuto in sequenza da un pozzetto all'altro.Quindi rimuovere gli strati adiposo ed epidermico con le forbici chirurgiche, lasciando intatto il derma. Utilizzare un paio di forbici per sezionare il derma tagliato in pezzi da tre a cinque millimetri quadrati e trasferire i pezzi al pozzetto successivo con un paio di pinze sterili. Lavare i pezzi in soluzione PBS PSA.Utilizzando una pinza sterilizzata, posizionare da 10 a 30 pezzi di tessuto dermico distanziati di meno di cinque millimetri in piastre di Petri. Mettere i piatti capovolti in un'incubatrice fino a quando i pezzi si asciugano e si attaccano al piatto. Quindi, aggiungere sette millilitri di DMEM integrato con 10% FBS e 1% PSA e incubare i piatti come prima.Dopo tre giorni, sostituire metà del surnatante con terreno di coltura completo. Osservare i fibroblasti ogni giorno sotto un ingrandimento microscopico 40X. Rimuovere i pezzi di tessuto nel terreno di coltura quando i fibroblasti raggiungono il 90% di confluenza.Lavare i fibroblasti in PBS e aggiungere due millilitri di soluzione sterile di tripsina EDTA. Dopo aver incubato le cellule in un incubatore umidificato, picchiettare delicatamente il piatto di coltura e osservarlo al microscopio. Aggiungere due millilitri di mezzo completo per terminare la digestione una volta che la maggior parte delle cellule si sono staccate.Ora trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri e centrifugare la provetta a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente. Scartare attentamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo completo. Seminare i fibroblasti in un piatto di coltura cellulare di nove centimetri e incubare in un incubatore umidificato.Per eseguire l'analisi immunofluorescente dopo aver coltivato i fibroblasti su vetrini rotondi e averli incubati in anticorpi primari e secondari, aggiungere 50 microlitri di soluzione DAPI al vetrino per colorare i nuclei cellulari. Posizionare le copertine lavate su vetrini con una pinza. Infine, trasferire i campioni in una scatola scura bagnata per la microscopia fluorescente.Le escrescenze di fibroblasti del tessuto sono state osservate cinque giorni dopo l'elaborazione. I fibroblasti hanno mostrato alti tassi di proliferazione e hanno raggiunto la confluenza dopo 10 giorni. I fibroblasti avevano corpi cellulari allungati e simili a fusi, che erano allineati in fasci ad alta confluenza.La colorazione immunofluorescente ha restituito immunofluorescenza rossa positiva dei fibroblasti e immunofluorescenza blu del nucleo cellulare. I test citometrici a flusso hanno mostrato positività CD90 in quasi tutti i fibroblasti. Questo studio ha descritto un metodo ottimizzato e fornito istruzioni chiare per risolvere le sfide esistenti e aumentare le possibilità di successo per l'isolamento e la coltura dei fibroblasti cheloidi.

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