Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号81903189および82073418)および広州科学技術財団(助成金番号202102020025)からの助成金によって支援されました。

この研究は、南部医科大学皮膚科病院の治験審査委員会によって承認されました(2020081)。個人から組織を採取する前に、インフォームド患者の同意を得た。
1. 事前準備
注意: 次の手順は、生物学的安全キャビネットの下の無菌環境で実行する必要があります。
<ol><li>高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)?...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

ケロイド組織から初代線維芽細胞を得ることは、さらなる研究のための重要な基盤です。これまで、初代線維芽細胞を獲得するには、酵素消化と外植片培養の2つの方法がありました11、12、13、14。ただし、どちらの従来の方法にも、汚染に対する感受性、他の種類の細胞との混合、長い培養期間?...

線維増殖性疾患であるケロイドは、プラークの継続的な成長として現れ、多くの場合、自己制限なしに周囲の正常な皮膚に侵入し、患者にさまざまな程度のかゆみ、痛み、美容的および心理的負担を引き起こします1。ケロイドに関与する初代細胞である線維芽細胞は、過剰な増殖、冗長な細胞外マトリックス産生、および無秩序なコラーゲンを通じて、この病気の形成と発症に不可欠な役割を果たします2,3。しかし、根底にある病因は不明であり、ケロイドの効果的な治療法はまだ不足しています。したがって、さらなる研究が急務です4,5。
in vivoでのケロイド研究に理想的な動物モデルがないため6,7,ケロイド組織から初代線維芽細胞を取得してin vitroモデルを構築することで、ケロイド研究の実現可能性と信頼性を提供できます2,6。初代細胞は生体組織から直接誘導される細胞であり、これらの細胞は細胞株と比較して複数の個体の生理学的状態および遺伝的背景により近いことが一般に認識されている8,9。初代細胞の培養は、細胞の成長と代謝、およびその他の細胞表現型を研究するための強力な手段を提供します。
現在、初代線維芽細胞を獲得するための2つの方法がある:酵素消化および外植片培養。しかし、初代線維芽細胞を得るには、さまざまな細菌や真菌による汚染のリスク、除去が容易ではない他の種類の細胞との混合、培養サイクルの長い期間、その後の元の細胞と比較した細胞特性の変化など、いくつかの障害が確認されています9.したがって、初代線維芽細胞を得るための実行可能で効果的なプロセスを開発することは、さらなる研究と応用の基礎となります。この研究では、ケロイド組織から初代線維芽細胞を抽出するための最適化されたプロトコルについて説明します 純粋で生存可能な線維芽細胞を効果的かつ着実に提供できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

ケロイド組織の主要な細胞型である線維芽細胞は、ケロイドの形成と発達に不可欠な役割を果たします。ケロイド組織に由来する初代線維芽細胞の単離と培養は、ケロイドの生物学的機能と分子メカニズム、およびそれらを治療するための新しい治療戦略のさらなる研究の基礎となります。初代線維芽細胞を得るための従来の方法には、細胞状態の悪さ、他の種類の細胞との混合、汚染に対する感受性などの制限があります。この論文では、線維芽細胞を取得する際に起こりうる問題の発生を減らすことができる、最適化され、簡単に再現できるプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、線維芽細胞は単離後5日で観察され、10日間の培養後にほぼ80%のコンフルエントに達することができます。次に、線維芽細胞を継代し、免疫蛍光アッセイ用のPDGFRαおよびビメンチン抗体およびフローサイトメトリー用のCD90抗体を使用して検証します。結論として、ケロイド組織からの線維芽細胞は、このプロトコルを介して容易に取得することができ、ケロイド研究のための実験室で豊富で安定した細胞源を提供することができます。

プロトコルのタイムラインを 図1Aにまとめます。分離プロセスの代表的な画像を 図2に示します。表皮層および脂肪層を注意深く除去し、真皮層を3〜4mm2の小さな断片に分離し、それらをペトリ皿に接種した。
図3Aに示すように、組織片のいくつかの線維芽細胞伸長物は、処理後5日目に顕微鏡?...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

この研究では、ケロイド組織から初代線維芽細胞を確立するための最適化されたプロトコルについて説明します 純粋で生存可能な線維芽細胞を効果的かつ着実に提供できます。

ヒトケロイド組織からの初代皮膚線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

ケロイド組織に由来する初代線維芽細胞の単離と培養は、ケロイドのさらなる研究の基礎となります。ケロイド組織からの線維芽細胞は、このプロトコルを介して容易に取得することができ、ケロイド研究のための実験室で豊富で安定した細胞源を提供することができます。滅菌ピンセットを使用して、1%PSAを添加した10〜25ミリリットルのPBSを含む50ミリリットルの滅菌遠心チューブにケロイド組織を配置することから始めます。その間、4ミリリットルのPBS PSA溶液を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。次に、ティッシュをチューブから取り出し、PBS PSA溶液で2回洗浄します。一対の滅菌鉗子を使用して、組織をあるウェルから次のウェルに順次移します。次に、外科用ハサミで脂肪層と表皮層を取り除き、真皮をそのままにします。ハサミを使用して、トリミングされた真皮を3〜5平方ミリメートルの小片に解剖し、滅菌鉗子で次のウェルに移します。PBS PSA溶液でピースを洗浄します。滅菌した鉗子を使用して、10〜30個の真皮組織片を5ミリメートル未満の間隔でペトリ皿に置きます。破片が乾いて皿にくっつくまで、皿を逆さまにしてインキュベーターに入れます。次に、10%FBSと1%PSAを添加した7ミリリットルのDMEMを加え、前と同じように皿をインキュベートします。3日後、上清の半分を完全培養液と交換する。線維芽細胞を40倍の顕微鏡倍率で毎日観察します。線維芽細胞が90%コンフルエントに達したら、培養液中の組織片を除去します。線維芽細胞をPBSで洗浄し、2ミリリットルの滅菌トリプシンEDTA溶液を加える。加湿インキュベーターで細胞をインキュベートした後、培養皿を軽くたたき、顕微鏡で観察します。2ミリリットルの完全培地を加えて、ほとんどの細胞が剥離したら消化を終了します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの滅菌遠心チューブに移し、チューブを300Gで室温で3分間遠心分離します。上清を注意深く廃棄し、細胞ペレットを完全培地に再懸濁します。線維芽細胞を9cmの細胞培養皿に播種し、加湿したインキュベーターでインキュベートします。丸いカバーガラス上で線維芽細胞を培養し、一次抗体と二次抗体でインキュベートした後、免疫蛍光分析を行うには、スライドガラスに50マイクロリットルのDAPI溶液を加えて細胞核を染色します。洗浄したカバーガラスを鉗子を使用してスライドガラスに置きます。最後に、サンプルを蛍光顕微鏡用の湿った暗箱に移します。処理後5日目に組織の線維芽細胞伸長が観察された。線維芽細胞は高い増殖率を示し、10日後にコンフルエントに達した。線維芽細胞は細長い紡錘状の細胞体を有し、それらは高いコンフルエント性で束に整列していた。免疫蛍光染色は、線維芽細胞の赤色免疫蛍光および細胞核の青色免疫蛍光を陽性に戻した。フローサイトメトリーアッセイは、ほぼすべての線維芽細胞においてCD90陽性を示した。この研究では、最適化された方法を説明し、既存の課題を解決し、ケロイド線維芽細胞の分離と培養の成功の可能性を高めるための明確な指示を提供しました。

Research

JoVE Journal

Medicine

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