Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
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이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81903189 및 82073418)과 광저우 과학 기술 재단 (보조금 번호 202102020025)의 보조금으로 지원되었습니다.

이 연구는 Southern Medical University(2020081)의 Dermatology Hospital의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 개인으로부터 조직을 수집하기 전에 정보에 입각한 환자 동의를 얻었습니다.
1. 준비
알림: 다음 절차는 생물학적 안전 캐비닛 아래의 무균 환경에서 수행해야 합니다.
<ol><li>10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

켈로이드 조직에서 일차 섬유아세포를 얻는 것은 추가 연구를 위한 중요한 기초입니다. 지금까지, 일차 섬유아세포를 획득하는 두 가지 방법이 있었다: 효소 소화 및 체외이식편 배양11,12,13,14. 그러나 두 가지 전통적인 방법 모두 오염에 대한 민감성, 다른 유형의 세포와의 혼합, 긴 배양 기간 및 낮은...

섬유증식성 질환인 켈로이드는 플라크가 지속적으로 증식하여 자가제한 없이 정상 피부 주변을 침범하는 경우가 많으며, 환자에게 다양한 정도의 가려움증, 통증, 미용적, 심리적 부담을 유발한다1. 켈로이드에 관여하는 일차 세포인 섬유아세포는 과도한 증식, 중복 세포외 기질 생성, 무질서한 콜라겐을 통해 이 질병의 형성과 발달에 필수적인 역할을 합니다 2,3. 그러나 근본적인 발병기전은 아직 불분명하며 켈로이드에 대한 효과적인 치료 방법은 여전히 부족합니다. 따라서 추가 연구가 시급히 필요합니다 4,5.
생체 내 켈로이드 연구를 위한 이상적인 동물 모델이 없기 때문에 6,7, 켈로이드 조직에서 1차 섬유아세포를 획득하여 시험관 내 모델을 구축하면 켈로이드 연구 2,6에 대한 타당성과 신뢰성을 제공할 수 있습니다. 일차 세포는 살아있는 조직에서 직접 유래한 세포이며, 이러한 세포는 세포주와 비교하여 여러 개체의 생리적 상태 및 유전적 배경과 더 유사할 수 있다는 것이 일반적으로 인식되고 있다 8,9. 일차 세포 배양은 세포의 성장과 대사뿐만 아니라 다른 세포 표현형을 연구하는 강력한 수단을 제공합니다.
현재, 1차 섬유아세포를 획득하는 두 가지 방법이 있다: 효소 소화 및 체외이식편 배양. 그러나, 다양한 박테리아 또는 곰팡이에 의한 오염의 위험성 , 쉽게 제거되지 않는 다른 유형의 세포와의 혼합, 배양 주기의 긴 기간, 원래 세포와 비교하여 세포 특성의 후속 변화 등과 같은 일차 섬유아세포를 얻는 데 몇 가지 장애물이 확인되었습니다9. 따라서 1차 섬유아세포를 얻기 위한 실현 가능하고 효과적인 공정을 개발하는 것이 추가 연구 및 적용을 위한 기초입니다. 이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직에서 일차 섬유아세포를 추출하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

켈로이드 조직의 주요 세포 유형인 섬유아세포는 켈로이드의 형성과 발달에 필수적인 역할을 합니다. 켈로이드 조직에서 유래한 일차 섬유아세포의 분리 및 배양은 켈로이드의 생물학적 기능 및 분자 메커니즘에 대한 추가 연구와 이를 치료하기 위한 새로운 치료 전략의 기초입니다. 1차 섬유아세포를 얻는 전통적인 방법은 열악한 세포 상태, 다른 유형의 세포와의 혼합 및 오염에 대한 감수성과 같은 한계가 있습니다. 이 논문은 섬유아세포를 얻을 때 발생할 수 있는 문제의 발생을 줄일 수 있는 최적화되고 쉽게 재현 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에서 섬유아세포는 분리 후 5일 후에 관찰할 수 있으며 배양 10일 후에 거의 80% 밀도에 도달할 수 있습니다. 이어서, 면역형광 분석을 위한 PDGFRα 및 비멘틴 항체 및 유세포 분석을 위한 CD90 항체를 사용하여 섬유아세포를 계대배양하고 검증한다. 결론적으로, 켈로이드 조직의 섬유아세포는 이 프로토콜을 통해 쉽게 얻을 수 있으며, 이는 켈로이드 연구를 위한 실험실에서 풍부하고 안정적인 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

프로토콜의 타임라인은 그림 1A에 요약되어 있습니다. 격리 프로세스의 일부 대표 이미지는 그림 2에 나와 있습니다. 표피층과 지방층을 조심스럽게 제거하고, 진피층을 3-4mm2의 작은 조각으로 분리하여 페트리 접시에 접종하였다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, 조직 조각의 여러 섬유아세포 성장을 처?...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직으로부터 1차 섬유아세포를 확립하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

켈로이드 조직에서 유래한 일차 섬유아세포의 분리 및 배양은 켈로이드에 대한 추가 연구의 기초입니다. 켈로이드 조직의 섬유아세포는 이 프로토콜을 통해 쉽게 획득할 수 있으며, 이는 켈로이드 연구를 위한 실험실에서 풍부하고 안정적인 세포 공급원을 제공할 수 있습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 1% PSA가 보충된 PBS 10-25밀리리터가 들어 있는 50밀리리터 멸균 원심분리기 튜브에 켈로이드 조직을 넣는 것으로 시작합니다.한편, 4 밀리리터의 PBS PSA 용액을 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 이제 튜브에서 티슈를 꺼내고 PBS PSA 용액으로 두 번 씻으십시오. 한 쌍의 멸균 집게를 사용하여 조직을 한 우물에서 다음 우물로 순차적으로 옮깁니다.그런 다음 수술 용 가위로 지방층과 표피층을 제거하고 진피는 그대로 둡니다. 가위를 사용하여 손질 된 진피를 3-5 평방 밀리미터 조각으로 해부하고 한 쌍의 멸균 집게로 조각을 다음 우물로 옮깁니다. PBS PSA 용액으로 조각을 씻으십시오.멸균 된 집게를 사용하여 10-30 개의 진피 조직 조각을 페트리 접시에 5mm 미만의 간격으로 놓습니다. 조각이 마를 때까지 인큐베이터에 접시를 거꾸로 놓고 접시에 붙입니다. 다음으로, 10% FBS 및 1% PSA가 보충된 7밀리리터의 DMEM을 첨가하고, 이전과 같이 접시를 배양한다.3 일 후, 상청액의 절반을 완전한 배양 배지로 교체하십시오. 섬유아세포를 매일 40X 현미경 배율로 관찰합니다. 섬유아세포가 90% 밀도에 도달하면 배양 배지에서 조직 조각을 제거합니다.섬유아세포를 PBS로 세척하고 멸균 트립신 EDTA 용액 2밀리리터를 첨가한다. 가습 인큐베이터에서 세포를 배양한 후 배양 접시를 가볍게 두드려 현미경으로 관찰합니다. 대부분의 세포가 분리되면 소화를 끝내기 위해 2 밀리리터의 완전한 배지를 추가하십시오.이제 세포 현탁액을 15 밀리리터 멸균 원심 분리 튜브로 옮기고 실온에서 3 분 동안 300G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상층액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 완전한 배지에 재현탁하십시오. 섬유아세포를 9cm 세포 배양 접시에 파종하고 가습 인큐베이터에서 배양합니다.둥근 커버슬립에서 섬유아세포를 배양하고 1차 및 2차 항체에서 배양한 후 면역형광 분석을 수행하려면 유리 슬라이드에 50마이크로리터의 DAPI 용액을 추가하여 세포핵을 염색합니다. 집게를 사용하여 세척 된 커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓습니다. 마지막으로 형광 현미경 검사를 위해 샘플을 습식 다크 박스로 옮깁니다.조직의 섬유아세포 성장은 처리 후 5일째에 관찰되었다. 섬유아세포는 높은 증식률을 보였고 10일 후에 합류도에 도달했습니다. 섬유아세포는 길쭉하고 방추형의 세포체를 가지고 있었고, 이들은 높은 밀도로 다발로 정렬되어 있었다.면역형광 염색은 섬유아세포의 양성 적색 면역형광과 세포핵의 청색 면역형광을 반환했습니다. 유세포 분석은 거의 모든 섬유아세포에서 CD90 양성을 보여주었습니다. 이 연구는 최적화된 방법을 설명하고 기존 문제를 해결하고 켈로이드 섬유아세포의 분리 및 배양에 대한 성공 가능성을 높이기 위한 명확한 지침을 제공했습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

연구

의학

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

인간의 전정 신경초종의 차 문화

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...