Name: isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81903189 ve 82073418 numaralı hibeler) ve Guangzhou Bilim ve Teknoloji Vakfı'ndan (202102020025 numaralı hibe) alınan hibelerle desteklenmiştir.

Bu çalışma, Güney Tıp Üniversitesi (2020081) Dermatoloji Hastanesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Bireylerden doku toplanmadan önce bilgilendirilmiş hasta onamları alındı.
1. Hazırlık
NOT: Aşağıdaki prosedürler biyolojik güvenlik kabini altında steril bir ortamda yapılmalıdır.
<ol><li>Yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerine (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptom...

<ol>
	<li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes.">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).</li><li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis.">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).</li><li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keloid+disorder:+Genetic+basis,+gene+expression+profiles,+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin.">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid.">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).</li><li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars:+A+critically+appraised+topic.">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li><li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring:+Human+and+animal+models.">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li><li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring.">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li><li>K&#252;nzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation.">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+explants+culture+method:+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics.">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations.">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition.">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).</li><li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization.">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li><li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+regulates+cell+growth,+apoptosis,+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+(TGF-beta)/SMAD+signaling+pathway.">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li><li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts.">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+explant+culture:+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts.">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia.">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815 (2021).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts.">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+PDGFR&#945;+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing.">Temporal control of PDGFR&#945; regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).</li><li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium.">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li></ol>

Keloid dokulardan primer fibroblastların elde edilmesi, daha ileri araştırmalar için kritik bir temeldir. Şimdiye kadar, primer fibroblastları elde etmek için iki yöntem vardı: enzim sindirimi ve eksplant kültürü11,12,13,14. Bununla birlikte, her iki geleneksel yöntemin de kontaminasyona yatkınlık, diğer hücre tipleriyle karışma, uzun bir kültür süresi ve düşük başarı...

Fibroproliferatif bir hastalık olan keloid, genellikle çevredeki normal cildi kendi kendini sınırlamadan istila eden ve hastalar için çeşitli derecelerde kaşıntı, ağrı ve kozmetik ve psikolojik yüklere neden olan plakların sürekli büyümesi olarak kendini gösterir1. Keloidlerde yer alan birincil hücreler olan fibroblastlar, aşırı proliferasyon, gereksiz hücre dışı matriks üretimi ve düzensiz kollajenler yoluyla bu hastalığın oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar 2,3. Bununla birlikte, altta yatan patogenez belirsizliğini korumaktadır ve keloid için etkili bir terapötik yöntem hala eksiktir; Bu nedenle, daha fazla araştırmaya acil ihtiyaç vardır 4,5.
İn vivo keloid araştırmaları için ideal bir hayvan modeli olmadığından, keloid dokulardan primer fibroblastlar elde ederek bir in vitro model oluşturmak, keloid araştırmaları için fizibilite ve güvenilirlik sağlayabilir 2,6. Birincil hücreler, doğrudan canlı dokudan türetilen hücrelerdir ve genel olarak bu hücrelerin, hücre dizilerine kıyasla birden fazla bireyin fizyolojik durumuna ve genetik arka planına daha yakından benzeyebileceği kabul edilmektedir 8,9. Birincil hücrelerin kültürlenmesi, hücrelerin büyümesini ve metabolizmasını ve diğer hücre fenotiplerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.
Şu anda, primer fibroblastları elde etmek için iki yöntem vardır: enzim sindirimi ve eksplant kültürü. Bununla birlikte, primer fibroblastların elde edilmesinde, çeşitli bakteri veya mantarlar tarafından kontaminasyon riski, kolayca çıkarılamayan diğer hücre türleri ile karışma, kültür döngüsünün uzun süresi, orijinal hücrelere kıyasla hücre özelliklerinde müteakip değişiklikler vb. gibi çeşitli engeller tanımlanmıştır 9. Bu nedenle, primer fibroblastların elde edilmesi için uygulanabilir ve etkili bir süreç geliştirmek, daha ileri çalışmalar ve uygulamalar için temel oluşturur. Bu çalışma, saf ve canlı fibroblastları etkili ve istikrarlı bir şekilde sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastların çıkarılması için optimize edilmiş bir protokolü tanımlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>CFT002015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% polyformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0099</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>8081</td>
			<td>Put keloid tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Alexa&#160;Fluor&#160;555&#160;</td>
			<td>second antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti human CD90</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>B301002</td>
			<td>Identify the purity of fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 series A2</td>
			<td>Isolation and culture cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>B265993</td>
			<td>Blocking for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td>Using for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cryotubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43513</td>
			<td>Store the cells in low temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal machine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>Discard supernatant&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C1006</td>
			<td>Stain the cellular nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td>Using for preserving cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD FACSCelesta</td>
			<td>Observing the identity of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen box</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;5100-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AIR-HD25</td>
			<td>Observing the immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#945; antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>3174T</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-Am solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td>Add in culture medium solution to avoid contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>7556</td>
			<td>Culture fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Culture medium solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5742S</td>
			<td>As a control for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslip</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>801007</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Punch holes in the cell membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Used for passaging cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8978</td>
			<td>First antibody for immunofluorescence staining assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary dermal fibroblasts from human keloid tissue

Keloid dokudaki ana hücre tipi olan fibroblastlar, keloidlerin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar. Keloid dokusundan türetilen primer fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloidlerin biyolojik fonksiyonu ve moleküler mekanizmalarının yanı sıra bunları tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler hakkında daha ileri çalışmaların temelini oluşturur. Primer fibroblastları elde etmenin geleneksel yöntemi, zayıf hücresel durum, diğer hücre tipleriyle karışma ve kontaminasyona yatkınlık gibi sınırlamalara sahiptir. Bu makale, fibroblast elde edilirken olası sorunların ortaya çıkmasını azaltabilecek optimize edilmiş ve kolayca tekrarlanabilir bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokolde fibroblastlar izolasyondan 5 gün sonra gözlenebilmekte ve 10 günlük kültürden sonra %80'e yakın birleşmeye ulaşabilmektedir. Daha sonra fibroblastlar, immünofloresan testleri için PDGFRa ve vimentin antikorları ve akış sitometrisi için CD90 antikorları kullanılarak pasajlanır ve doğrulanır. Sonuç olarak, keloid dokusundan fibroblastlar, keloid araştırmaları için laboratuvarda bol ve stabil bir hücre kaynağı sağlayabilen bu protokol aracılığıyla kolayca elde edilebilir.

Protokolün zaman çizelgesi Şekil 1A'da özetlenmiştir. İzolasyon sürecinin bazı temsili görüntüleri Şekil 2'de gösterilmektedir; epidermis ve yağ tabakaları dikkatlice çıkarıldı ve dermis tabakası 3-4mm2'lik küçük parçalara ayrıldı ve bunlar Petri kaplarına aşılandı.
Şekil 3A'da gösterildiği gibi, işlemden 5 gün sonra mikroskop altında doku parçalarında ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Bu çalışma, etkili ve istikrarlı bir şekilde saf ve canlı fibroblastlar sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastlar oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

Keloid dokusundan türetilen primer fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloidlerin daha ileri çalışmaları için temel oluşturur. Keloid dokusundan fibroblastlar, keloid araştırmaları için laboratuvarda bol ve stabil bir hücre kaynağı sağlayabilen bu protokol aracılığıyla kolayca elde edilebilir. Keloid dokusunu% 1 PSA ile desteklenmiş 10 ila 25 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne yerleştirmek için steril cımbız kullanarak başlayın.Bu arada, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dört mililitre PBS PSA çözeltisi ekleyin. Şimdi dokuyu tüpten çıkarın ve PBS PSA çözeltisi ile iki kez yıkayın. Bir çift steril forseps kullanarak, dokuyu sırayla bir kuyudan diğerine aktarın.Daha sonra yağ ve epidermis katmanlarını cerrahi makasla çıkarın, dermise dokunmayın. Kesilen dermisi üç ila beş milimetre karelik parçalara ayırmak için bir makas kullanın ve parçaları bir çift steril forseps ile bir sonraki kuyuya aktarın. Parçaları PBS PSA solüsyonunda yıkayın.Sterilize edilmiş forseps kullanarak, Petri kaplarına beş milimetreden daha az aralıklarla yerleştirilmiş 10 ila 30 dermis doku parçası yerleştirin. Bulaşıkları, parçalar kuruyana kadar bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin ve tabağa yapıştırın. Daha sonra,% 10 FBS ve% 1 PSA ile desteklenmiş yedi mililitre DMEM ekleyin ve bulaşıkları daha önce olduğu gibi inkübe edin.Üç gün sonra, süpernatantın yarısını tam kültür ortamıyla değiştirin. Fibroblastları günlük olarak 40X mikroskobik büyütme altında gözlemleyin. Fibroblastlar% 90'a ulaştığında kültür ortamındaki doku parçalarını çıkarın.Fibroblastları PBS'de yıkayın ve iki mililitre steril tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe ettikten sonra, kültür kabına hafifçe vurun ve mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin çoğu ayrıldıktan sonra sindirimi sona erdirmek için iki mililitre tam ortam ekleyin.Şimdi hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücre peletini tam ortamda yeniden süspanse edin. Fibroblastları dokuz santimetrelik bir hücre kültürü kabına tohumlayın ve nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.Fibroblastları yuvarlak lameller üzerinde kültürledikten ve bunları birincil ve ikincil antikorlarda inkübe ettikten sonra immünofloresan analizi yapmak için, hücresel çekirdeği boyamak için cam slayta 50 mikrolitre DAPI çözeltisi ekleyin. Yıkanmış lamelleri forseps kullanarak cam slaytların üzerine yerleştirin. Son olarak, numuneleri floresan mikroskobu için ıslak bir karanlık kutuya aktarın.İşlemden beş gün sonra dokuda fibroblast büyümesi gözlendi. Fibroblastlar yüksek proliferasyon oranları gösterdi ve 10 gün sonra birleşmeye ulaştı. Fibroblastlar, yüksek birleşmede demetler halinde hizalanmış uzun ve iğ benzeri hücre gövdelerine sahipti.İmmünofloresan boyama, fibroblastların pozitif kırmızı immünofloresansını ve hücresel çekirdeğin mavi immünofloresansını döndürdü. Flow sitometrik testler hemen hemen tüm fibroblastlarda CD90 pozitifliği gösterdi. Bu çalışma, optimize edilmiş bir yöntemi tanımlamış ve mevcut zorlukları çözmek ve keloid fibroblastların izolasyonu ve kültürü için başarı şansını artırmak için net talimatlar sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

İnsan Vestibüler Schwannomalar İlköğretim Kültürü

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...