Name: microgel-extracellular matrix composite support for the embedded 3d printing of human neural constructs
Uploaded: 2023-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs at JoVE.com

Het onderzoek werd voornamelijk gefinancierd door het BrainMatTrain European Union Horizon 2020-programma (nr. H2020-MSCA-ITN-2015) onder het Marie Skłodowska- Curie Initial Training Network and Grant Agreement No. 676408. C.R. en J.U.L. willen de Lundbeck Foundation (R250-2017-1425) en het Independent Research Fund Denmark (8048-00050) bedanken voor hun steun. We zijn dankbaar voor de financiering van het HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01-project 101047177 OpenMIND.

1. Bereiding van de buffers en reagentia
<ol><li>Bereid celgroeimedium voor door de volgende supplementen toe te voegen aan DMEM / F12 met L-alanyl-L-glutaminedipeptide: 30 mM glucose, 5 μM HEPES, 0,5% w / v lipiderijke runderserumalbumine, 40 μM L-alanine, 40 μM L-asparaginemonohydraat, 40 μM L-asparaginezuur, 40 μM L-glutaminezuur, 40 μM L-proline, 1% N2-supplement, 1% penicilline-streptomycine en 20 ng / L elk van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblastgroeifactor (FGF). Voer deze stappen u...

<ol>
	<li>Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omnidirectional+printing+of+3D+microvascular+networks.">Omnidirectional printing of 3D microvascular networks.</a> Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).</li><li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Writing+in+the+granular+gel+medium.">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).</li><li>Skylar-Scott, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomanufacturing+of+organ-specific+tissues+with+high+cellular+density+and+embedded+vascular+channels.">Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels.</a> Science Advances. 5 (9), (2019).</li><li>Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+3D+printing+of+shear-thinning+hydrogels+into+self-healing+hydrogels.">Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Noor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+personalized+thick+and+perfusable+cardiac+patches+and+hearts.">3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts.</a> Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>LeBlanc, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+high+speed+3D+printing+in+liquid-like+solids.">Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).</li><li>Prendergast, M. E., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+modeling+and+experimental+characterization+of+extrusion+printing+into+suspension+baths.">Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).</li><li>Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+support+media+for+high+resolution+3D+printing+of+volumetric+cell-containing+ECM+structures.">Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures.</a> Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).</li><li>McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+in+suspension+baths:+Keeping+the+promises+of+bioprinting+afloat.">3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat.</a> Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).</li><li>Kajtez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+3D+printing+in+self-healing+annealable+composites+for+precise+patterning+of+functionally+mature+human+neural+constructs.">Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs.</a> Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).</li><li>Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlinked+macroporous+3D+scaffolds+from+microgel+rods.">Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+slurry+as+a+support+medium+for+bioprinting+and+culturing+freestanding+cell-laden+hydrogel+constructs.">Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).</li></ol>

De SHAPE composite material benadering biedt een veelzijdige route voor de formulering van gloeibare en biofunctionele ondersteuningsbaden voor het ingebed 3D-printen van cellulaire inkten. Hoewel dit protocol een voorbeeld is van het 3D-printen van neurale constructies, kan de SHAPE-toolbox eenvoudig worden aangepast aan biofabricage met andere celbronnen voor de precieze engineering van een reeks doelweefseltypen. De printbenadering zou ook de precieze patronen van meerdere celtypen mogelijk maken om hun interactie te ...

Het nauwkeurig en programmeerbaar 3D-printen van met cellen beladen hydrogelconstructies die zachte weefsels in vitro nabootsen, vormt een grote uitdaging. Pogingen op basis van de directe extrusie van zachte hydrogels zijn bijvoorbeeld inherent problematisch, omdat de slechte mechanische eigenschappen die nodig zijn om de in vivo micro-omgeving samen te vatten, leiden tot een gebrek aan structurele integriteit, vervormingen van de vooraf gedefinieerde kenmerken of de volledige ineenstorting van de gefabriceerde structuren. Een conventionele oplossing voor dit probleem is om een ondersteunende steiger af te drukken van een stijver biocompatibel materiaal waarmee de uiteindelijke constructie zijn vorm kan behouden. Deze aanpak beperkt echter de ontwerpmogelijkheden sterk en vereist een zorgvuldige reologische fijnafstemming van de aangrenzende inkten.
Om de beperkingen van het traditionele laag-voor-laag extrusie-gebaseerde 3D-printen te overwinnen, is embedded 3D-printen de afgelopen jaren naar voren gekomen als een krachtig alternatief voor de fabricage van zacht materiaal en weefsel 1,2,3,4,5,6. In plaats van de inkt in omgevingslucht bovenop een oppervlak te extruderen, wordt de inkt rechtstreeks via een spuitnaald afgezet in een steunbad dat in rust vastelijk, maar omkeerbaar fluïdiseert rond de bewegende naaldpunt om de precieze afzetting van zacht celbeladen materiaal mogelijk te maken. Het afgezette materiaal wordt op zijn plaats gehouden terwijl de steun opnieuw wordt geslingerd in het kielzog van de naald. Als zodanig maakt ingebed 3D-printen de hoge resolutie vrije vorm fabricage van ingewikkelde structuren uit zachte biomaterialen met uitgebreide ontwerpmogelijkheden 7,8.
Granulaire gels zijn uitgebreid onderzocht als ondersteunende badmaterialen voor ingebed 3D-printen, omdat ze kunnen worden geformuleerd om gladde, gelokaliseerde en omkeerbare overgangen van vaste stof naar vloeistof te vertonen bij lage vloeispanningen 9,10,11. Hoewel ze uitstekende reologische eigenschappen vertonen voor afdrukken met hoge resolutie, zijn korrelige gels beperkt tot een handvol biomaterialen12. Het gebrek aan diversiteit in korrelige gelformuleringen, wat vooral duidelijk is als men kijkt naar het brede scala aan biomaterialen dat beschikbaar is voor bulk hydrogelformuleringen, wordt veroorzaakt door de behoefte aan de kosteneffectieve generatie van een groot aantal microgels met behulp van eenvoudige chemicaliën. Vanwege het beperkte biomateriaallandschap van korrelige gelsteunen, vormt de afstemming van de extracellulaire micro-omgeving die door de printondersteuning wordt geboden een uitdaging in het veld.
Onlangs is een modulaire aanpak ontwikkeld voor het genereren van ingebedde 3D-printsteunen, genaamd self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites13. Deze aanpak combineert de verschillende reologische eigenschappen van korrelige gels met de biofunctionele veelzijdigheid van bulk hydrogelformuleringen. De gepresenteerde SHAPE composiet ondersteuning bestaat uit verpakte alginaat microdeeltjes (korrelfase, ~70% volumefractie) met een verhoogde interstitiële ruimte gevuld met een viskeuze collageen-gebaseerde ECM pregel oplossing (continue fase, ~30% volume fractie). Verder is aangetoond dat de SHAPE-ondersteuning de hoge resolutie afzetting van menselijke neurale stamcellen (hNSC's) vergemakkelijkt die, na het gloeien van het ondersteuningsbad, kunnen worden gedifferentieerd in neuronen en wekenlang kunnen worden gehandhaafd om functionele rijping te bereiken. Ingebed 3D-printen in het SHAPE-ondersteuningsbad overwint enkele van de belangrijkste beperkingen met betrekking tot conventionele technieken voor neurale weefselbiofabricage en biedt tegelijkertijd een veelzijdig platform.
Dit werk beschrijft de stappen voor het ingebedde 3D-printen van hNSC's in de SHAPE-ondersteuning en hun daaropvolgende differentiatie in functionele neuronen (figuur 1). Ten eerste worden alginaatmicrodeeltjes gegenereerd via afschuiving tijdens interne gelatie. Deze aanpak maakt het mogelijk om eenvoudig grote hoeveelheden microdeeltjes te genereren zonder de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur en cytotoxische reagentia. Bovendien is alginaat een algemeen beschikbare en economische materiaalbron voor de vorming van biocompatibele hydrogelsubstraten voor een breed scala aan celtypen. De gegenereerde alginaatmicrodeeltjes worden gecombineerd met een collageenoplossing om het SHAPE composietondersteuningsmateriaal te vormen. Vervolgens worden de hNSC's geoogst en in een spuit geladen als cellulaire bioink voor 3D-printen. Een 3D-bioprinter wordt gebruikt voor het extrusie-gebaseerde embedded printen van hNSC's in de SHAPE-composiet. De 3D-geprinte cellen worden gedifferentieerd in neuronen om aanleiding te geven tot ruimtelijk gedefinieerde en functionele menselijke neurale constructies. Ten slotte beschrijft het protocol hoe de gegenereerde weefselconstructies kunnen worden gekarakteriseerd met behulp van live-cell imaging en immunocytochemie. Daarnaast worden tips gegeven voor optimalisatie en probleemoplossing. Met name kunnen zowel de componenten van de granulaire als de continue fasen worden uitgewisseld met andere hydrogelformuleringen om verschillende biofunctionele moieties, mechanische eigenschappen en crosslinking-mechanismen te accommoderen, zoals vereist door andere cel- en weefseltypen buiten neurale toepassingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Gastight Syringe 1001 TLL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DDiscovery 3D bioprinter</td>
			<td>RegenHU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Goat anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Needle, Sterican (21 G)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9180109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Needle (27 G)</td>
			<td>Cellink</td>
			<td>NZ5270505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCAD software</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0853-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3718-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>212-GD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RET basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3622000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S25N-10G dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4447100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Alginate (80-120 cP)</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>194-13321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3720000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBB3 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801213</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthan gum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microgel-extracellular matrix composite support for the embedded 3d printing of human neural constructs

Het ingebedde 3D-printen van cellen in een granulair ondersteuningsmedium is in het afgelopen decennium naar voren gekomen als een krachtige benadering voor de vrije vorm biofabricage van weke delen constructies. Granulaire gelformuleringen zijn echter beperkt tot een beperkt aantal biomaterialen die de kosteneffectieve generatie van grote hoeveelheden hydrogelmicrodeeltjes mogelijk maken. Daarom hebben granulaire gelondersteuningsmedia over het algemeen de celklevende en celinstructieve functies gemist die worden aangetroffen in de native extracellulaire matrix (ECM).
Om dit aan te pakken is een methodologie ontwikkeld voor het genereren van zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrix (SHAPE) composieten. SHAPE-composieten bestaan uit een korrelige fase (microgels) en een continue fase (viskeuze ECM-oplossing) die samen zowel programmeerbare high-fidelity printing als een instelbare biofunctionele extracellulaire omgeving mogelijk maken. Dit werk beschrijft hoe de ontwikkelde methodologie kan worden gebruikt voor de precieze biofabricage van menselijke neurale constructies.
Ten eerste worden alginaatmicrodeeltjes, die dienen als de korrelige component in de SHAPE-composieten, vervaardigd en gecombineerd met een op collageen gebaseerde continue component. Vervolgens worden menselijke neurale stamcellen in het ondersteuningsmateriaal geprint, gevolgd door het gloeien van de ondersteuning. De geprinte constructies kunnen wekenlang worden onderhouden om de differentiatie van de geprinte cellen in neuronen mogelijk te maken. Tegelijkertijd zorgt de continue fase van collageen voor axonale uitgroei en de onderlinge verbinding van regio's. Ten slotte biedt dit werk informatie over het uitvoeren van live-cell fluorescentie beeldvorming en immunocytochemie om de 3D-geprinte menselijke neurale constructies te karakteriseren.

Alginaat microgel preparaat via shear thinning tijdens interne gelation gevolgd door mechanische fragmentatie levert alginaat microgels op die polydispersed in grootte en schilferachtig van vorm zijn zoals te zien in figuur 2G. De grootte van deze onregelmatige deeltjes varieert van minder dan 1 μm tot ongeveer 40 μm in diameter. Dicht opeengepakt vormen de microdeeltjes een transparant bulkmateriaal dat slechts iets ondoorzichtiger is dan het overeenkomstige celkweekmedium (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs at JoVE.com

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

Dit werk beschrijft een protocol voor de vrije vorm ingebed 3D-printen van neurale stamcellen in zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrixcomposieten. Het protocol maakt het mogelijk om met hoge getrouwheid patronen te maken van onderling verbonden menselijke neurale weefselconstructies.

Microgel-extracellulaire matrixcomposietondersteuning voor het ingebed 3D-printen van menselijke neurale constructies

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...

Ingebed 3D-printen in SHAPE-composieten overwint traditionele biofabricagebeperkingen om nauwkeurige patronen van mechanisch gevoelige weefsels in hydrogels mogelijk te maken die lijken op de oorspronkelijke extracellulaire omgeving. SHAPE toolbox vertrouwt op modulair biomateriaalontwerp, waardoor eenvoudige wijzigingen in de formulering van de afdrukondersteuning mogelijk zijn. Het maakt ook gebruik van goedkope materialen en toegankelijke apparatuur voor eenvoudige aanpassing door andere onderzoeksgroepen.Deze benadering kan worden toegepast om ruimtelijk gedefinieerde menselijke neurale weefselmodellen te creëren voor het onderzoeken van neuronale ontwikkeling en communicatie bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals Parkinson. Begin met het bereiden van calciumcarbonaatoplossing in ultrapuur water met een concentratie van twee milligram per milliliter. Meng het met de alginaatoplossing in een gelijke verhouding en roer het magnetisch bij 650 RPM gedurende een uur bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens azijnzuur toe aan dit mengsel in een verhouding van één tot 500 en roer opnieuw een nacht. Fragmenteer de volgende dag de gelei alginaatoplossing mechanisch in microdeeltjes bij 15.000 RPM gedurende 10 minuten met behulp van een homogenisator. Centrifugeer vervolgens om de microdeeltjes te verkrijgen.Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspendien de deeltjes in de DMEM, die twee millimolaire natriumhydroxide en 1% penicillinestreptomycine bevatten. De kleur van de suspensie moet weer rood worden. Incubeer de suspensie 's nachts bij vier graden Celsius.Na incubatie, homogeniseer de suspensie gedurende drie minuten bij 15.000 RPM en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 18.500 G. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en observeer de pellet op dicht opeengepakte alginaatmicrodeeltjes. Om het SHAPE-composiet te genereren, mengt u de alginaatmicrodeeltjespellet met verdund en geneutraliseerd collageen in een verhouding van twee tot één en pipet u het op en neer op ijs.Breng het gegenereerde composietmateriaal over in een gekoelde 24-putplaat. Dissocieer voor het afdrukken de eerder gekweekte menselijke neurale stamcellen of hNSC's met behulp van een 0,025% trypsine-oplossing gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Neutraliseer vervolgens de trypsine met het groeimedium en centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 400 G.Na het verwijderen van het supernatant, resuspendien de celkorrel in twee tot drie milliliter groeimedium. Laad met behulp van een 21 gauge stompe metalen naald 100 microliter dicht opeengepakte alginaat microdeeltjes in de spuit. Laad vervolgens de voorbereide celsuspensie in een spuit.Vervang voor het afdrukken de laadnaald door een 27 gauge stompe metalen naald. Met behulp van software waarnaar wordt verwezen, klikt u, zodra de af te drukken structuur is ontworpen, op genereren voor het genereren voor het genereren van een G-codegeneratie. Plaats de met cellen geladen spuit in een volumetrische extrusiekop op een op extrusie gebaseerde bioprinter en noteer de naaldlengte door te klikken op het starten van het naaldlengtemeetproces.Plaats vervolgens de 24-putplaat geladen met SHAPE-composiet op de printer en klik op SHM om de hoogte van het lege putoppervlak te meten. Selecteer pH 2 gevolgd door het moersleutelsymbool. Wijzig vervolgens onder de parameterset het volumedebiet in 3,6 microliter per seconde en druk op Parameter toepassen, gevolgd door Opslaan en Gereed.Laad de G-code in de gebruikersinterface van de printer door op een pictogram voor open G-code te klikken. Selecteer het pictogram voor het programma uitvoeren om de afdrukprocedure te starten. Incubeer de SHAPE-gel onmiddellijk na het afdrukken gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius voor het gloeien.Voeg vervolgens voorzichtig groeimedium toe aan de gegloeide SHAPE-gelondersteuning. Verwijder voor immunostaining het overtollige medium uit de gel en breng de gel met behulp van een spatel over in een container met DPBS. Zodra de plaat in de zuurkast is geplaatst, verwijdert u de DPBS.Bedek de gel met 4% formaldehyde-oplossing en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Voeg na het wassen met DPBS de blokkerende oplossing toe aan de gel. Rock de plaat zachtjes en incubeer gedurende zes uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen.Zodra de blokkerende oplossing is verwijderd, voegt u het primaire antilichaam toe aan de gel en wiegt u het zachtjes. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij vier graden Celsius. Na DPBS-wassen, behandel de gel op dezelfde manier met de secundaire antilichaamoplossing gedurende 24 uur.Plaats de gekleurde gel met een spatel in een putplaat met een dunne beeldvormende bodem voordat u de afbeelding maakt. In de huidige studie printte de hNSC-inkt een filament van cellen met een diameter van ongeveer 200 micrometer. De geprinte strengen waren rijk aan levensvatbare cellen met rondom morfologie.Na 30 dagen printen vertoonden de cellen neurale morfologie met kleine cellichamen en lange dunne processen, wat wees op de succesvolle differentiatie van hNSC's. Kleuring met tubuline bèta drie maakte visualisatie van de gegenereerde neurale netwerken met behoud van geometrie mogelijk. En tijdens het differentiatieproces migreerden de cellen niet uit de geprinte strengen.SHAPE-composiet kan worden gebruikt om doorlaatbare kanalen te produceren door opofferingsinkt te printen in plaats van cellen. Bovendien kan de ondersteuning zuurstofgevoelige kralen bevatten om de zuurstofspanning in 3D-geprinte structuren in tijd en ruimte te bewaken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Vlakke en Three-Dimensional Printing van geleidende inkten

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human kraakbeenweefsel Fabrication behulp van drie-dimensionale Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Hoge resolutie 3D beeldvorming van het Neuro-insulaire netwerk van menselijke alvleesklier

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Nieuwe proces voor afdrukken in 3D Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...