Name: microgel-extracellular matrix composite support for the embedded 3d printing of human neural constructs
Uploaded: 2023-05-05T15:00:00
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Die Forschung wurde hauptsächlich durch das BrainMatTrain Horizon 2020 Programm der Europäischen Union (Nr. H2020-MSCA-ITN-2015) im Rahmen des Marie Skłodowska-Curie Initial Training Network und der Finanzhilfevereinbarung Nr. 676408 finanziert. C.R. und J.U.L. bedanken sich bei der Lundbeck Foundation (R250-2017-1425) und dem Independent Research Fund Denmark (8048-00050) für ihre Unterstützung. Wir bedanken uns für die Förderung des Projekts HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.

1. Vorbereitung der Puffer und Reagenzien
<ol><li>Stellen Sie Zellwachstumsmedium her, indem Sie DMEM/F12 die folgenden Ergänzungen mit L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid hinzufügen: 30 mM Glukose, 5 μM HEPES, 0,5 % w/v lipidreiches Rinderserumalbumin, 40 μM L-Alanin, 40 μM L-Asparagin-Monohydrat, 40 μM L-Asparaginsäure, 40 μM L-Glutaminsäure, 40 μM L-Prolin, 1 % N2-Ergänzung, 1 % Penicillin-Streptomycin und je 20 ng/l epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF). Führ...

<ol>
	<li>Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omnidirectional+printing+of+3D+microvascular+networks.">Omnidirectional printing of 3D microvascular networks.</a> Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).</li><li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Writing+in+the+granular+gel+medium.">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).</li><li>Skylar-Scott, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomanufacturing+of+organ-specific+tissues+with+high+cellular+density+and+embedded+vascular+channels.">Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels.</a> Science Advances. 5 (9), (2019).</li><li>Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+3D+printing+of+shear-thinning+hydrogels+into+self-healing+hydrogels.">Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Noor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+personalized+thick+and+perfusable+cardiac+patches+and+hearts.">3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts.</a> Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>LeBlanc, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+high+speed+3D+printing+in+liquid-like+solids.">Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).</li><li>Prendergast, M. E., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+modeling+and+experimental+characterization+of+extrusion+printing+into+suspension+baths.">Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).</li><li>Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+support+media+for+high+resolution+3D+printing+of+volumetric+cell-containing+ECM+structures.">Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures.</a> Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).</li><li>McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+in+suspension+baths:+Keeping+the+promises+of+bioprinting+afloat.">3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat.</a> Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).</li><li>Kajtez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+3D+printing+in+self-healing+annealable+composites+for+precise+patterning+of+functionally+mature+human+neural+constructs.">Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs.</a> Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).</li><li>Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlinked+macroporous+3D+scaffolds+from+microgel+rods.">Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+slurry+as+a+support+medium+for+bioprinting+and+culturing+freestanding+cell-laden+hydrogel+constructs.">Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).</li></ol>

Der SHAPE-Verbundwerkstoffansatz bietet einen vielseitigen Weg für die Formulierung von glühbaren und biofunktionalen Trägerbädern für den eingebetteten 3D-Druck von zellulären Tinten. Während dieses Protokoll ein Beispiel für den 3D-Druck neuronaler Konstrukte darstellt, könnte die SHAPE-Toolbox leicht an die Biofabrikation mit anderen Zellquellen angepasst werden, um eine Reihe von Zielgewebetypen präzise zu entwickeln. Der Druckansatz würde auch die präzise Strukturierung mehrerer Zelltypen ermöglichen, u...

Der präzise und programmierbare 3D-Druck von zellbeladenen Hydrogel-Konstrukten, die Weichgewebe in vitro nachahmen, stellt eine große Herausforderung dar. Zum Beispiel sind Versuche, die auf der direkten Extrusion von weichen Hydrogelen basieren, von Natur aus problematisch, da die schlechten mechanischen Eigenschaften, die erforderlich sind, um die In-vivo-Mikroumgebung zu rekapitulieren, zu einem Mangel an struktureller Integrität, zu Verformungen der vordefinierten Merkmale oder zum vollständigen Kollaps der hergestellten Strukturen führen. Eine konventionelle Problemumgehung für dieses Problem besteht darin, ein Stützgerüst aus einem steiferen biokompatiblen Material zu drucken, das es dem endgültigen Konstrukt ermöglicht, seine Form beizubehalten. Dieser Ansatz schränkt jedoch die Gestaltungsmöglichkeiten stark ein und erfordert eine sorgfältige rheologische Feinabstimmung der angrenzenden Tinten.
Um die Einschränkungen des traditionellen schichtweise extrusionsbasierten 3D-Drucks zu überwinden, hat sich der eingebettete 3D-Druck in den letzten Jahren zu einer leistungsstarken Alternative für die Herstellung von weichem Material und Gewebe entwickelt 1,2,3,4,5,6. Anstatt die Tinte in der Umgebungsluft auf einer Oberfläche zu extrudieren, wird die Tinte direkt durch eine Spritzennadel in einem Stützbad abgeschieden, das im Ruhezustand feststoffartig ist, aber reversibel um die bewegliche Nadelspitze herum fluidisiert, um die präzise Abscheidung von weichem, zellbeladenem Material zu ermöglichen. Das abgeschiedene Material wird an Ort und Stelle gehalten, während sich der Träger im Nachlauf der Nadel wieder verfestigt. So ermöglicht der eingebettete 3D-Druck die hochauflösende Freiformherstellung komplizierter Strukturen aus weichen Biomaterialien mit erweiterten Gestaltungsmöglichkeiten 7,8.
Granulare Gele wurden ausgiebig als Stützbadmaterialien für den eingebetteten 3D-Druck untersucht, da sie so formuliert werden können, dass sie glatte, lokalisierte und reversible Fest-Flüssig-Übergänge bei niedrigen Streckspannungen aufweisen 9,10,11. Während sie hervorragende rheologische Eigenschaften für den hochauflösenden Druck aufweisen, wurden granulare Gele bisher auf eine Handvoll Biomaterialien beschränkt12. Die mangelnde Vielfalt an granulierten Gelformulierungen, die besonders deutlich wird, wenn man die breite Palette von Biomaterialien betrachtet, die für Hydrogel-Bulk-Formulierungen zur Verfügung stehen, wird durch die Notwendigkeit der kostengünstigen Herstellung einer großen Anzahl von Mikrogelen mit einfachen Chemikalien verursacht. Aufgrund der begrenzten Biomateriallandschaft granularer Gelträger stellt die Abstimmung der extrazellulären Mikroumgebung, die durch den Druckträger bereitgestellt wird, eine Herausforderung in diesem Bereich dar.
In jüngster Zeit wurde ein modularer Ansatz für die Erzeugung von eingebetteten 3D-Druckträgern entwickelt, der als selbstheilende annealable particle-extracellular matrix (SHAPE)-Verbundwerkstoffebezeichnet wird 13. Dieser Ansatz kombiniert die unterschiedlichen rheologischen Eigenschaften von granularen Gelen mit der biofunktionellen Vielseitigkeit von Bulk-Hydrogel-Formulierungen. Der vorgestellte SHAPE-Composite-Träger besteht aus gepackten Alginat-Mikropartikeln (granulare Phase, ~70% Volumenanteil) mit einem vergrößerten interstitiellen Raum, der mit einer viskosen kollagenbasierten ECM-Pregellösung (kontinuierliche Phase, ~30% Volumenanteil) gefüllt ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der SHAPE-Träger die hochauflösende Ablagerung von humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) ermöglicht, die nach dem Ausglühen des Trägerbades zu Neuronen differenziert und wochenlang aufrechterhalten werden können, um eine funktionelle Reifung zu erreichen. Der eingebettete 3D-Druck im Inneren des SHAPE-Stützbades überwindet einige der wichtigsten Einschränkungen im Zusammenhang mit herkömmlichen Techniken für die Biofabrikation von Nervengewebe und bietet gleichzeitig eine vielseitige Plattform.
Diese Arbeit beschreibt die Schritte für den eingebetteten 3D-Druck von hNSCs innerhalb des SHAPE-Trägers und ihre anschließende Differenzierung in funktionelle Neuronen (Abbildung 1). Zunächst werden Alginat-Mikropartikel durch Scherung während der internen Gelierung erzeugt. Dieser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung großer Mengen von Mikropartikeln, ohne dass spezielle Geräte und zytotoxische Reagenzien erforderlich sind. Darüber hinaus ist Alginat eine weit verbreitete und kostengünstige Materialquelle für die Bildung biokompatibler Hydrogelsubstrate für eine Vielzahl von Zelltypen. Die erzeugten Alginat-Mikropartikel werden mit einer Kollagenlösung kombiniert, um das SHAPE-Komposit-Trägermaterial zu bilden. Anschließend werden die hNSCs geerntet und als zelluläre Biotinte für den 3D-Druck in eine Spritze geladen. Ein 3D-Biodrucker wird für den extrusionsbasierten eingebetteten Druck von hNSCs im Inneren des SHAPE-Verbundwerkstoffs verwendet. Die 3D-gedruckten Zellen werden zu Neuronen differenziert, so dass räumlich definierte und funktionelle menschliche neuronale Konstrukte entstehen. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie die erzeugten Gewebekonstrukte mittels Lebendzellbildgebung und Immunzytochemie charakterisiert werden können. Zusätzlich werden Tipps zur Optimierung und Fehlerbehebung gegeben. Insbesondere konnten sowohl die Komponenten der granularen als auch der kontinuierlichen Phase mit anderen Hydrogelformulierungen ausgetauscht werden, um unterschiedliche biofunktionelle Einheiten, mechanische Eigenschaften und Vernetzungsmechanismen zu berücksichtigen, wie sie von anderen Zell- und Gewebetypen jenseits neuronaler Anwendungen benötigt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Gastight Syringe 1001 TLL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DDiscovery 3D bioprinter</td>
			<td>RegenHU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Goat anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Needle, Sterican (21 G)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9180109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Needle (27 G)</td>
			<td>Cellink</td>
			<td>NZ5270505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCAD software</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0853-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3718-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>212-GD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RET basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3622000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S25N-10G dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4447100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Alginate (80-120 cP)</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>194-13321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3720000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBB3 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801213</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthan gum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microgel-extracellular matrix composite support for the embedded 3d printing of human neural constructs

Der eingebettete 3D-Druck von Zellen in einem granularen Trägermedium hat sich in den letzten zehn Jahren zu einem leistungsstarken Ansatz für die Freiform-Biofabrikation von Weichteilkonstrukten entwickelt. Granulierte Gelformulierungen sind jedoch auf eine begrenzte Anzahl von Biomaterialien beschränkt, die die kostengünstige Erzeugung großer Mengen von Hydrogel-Mikropartikeln ermöglichen. Daher fehlten granularen Gelträgermedien im Allgemeinen die zelladhäsiven und zellinstruktiven Funktionen, die in der nativen extrazellulären Matrix (EZM) zu finden sind.
Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Methodik zur Erzeugung von selbstheilenden annealbaren Partikel-extrazellulären Matrix-Kompositen (SHAPE) entwickelt. SHAPE-Verbundwerkstoffe bestehen aus einer granularen Phase (Mikrogele) und einer kontinuierlichen Phase (viskose ECM-Lösung), die zusammen sowohl einen programmierbaren High-Fidelity-Druck als auch eine einstellbare biofunktionelle extrazelluläre Umgebung ermöglichen. Diese Arbeit beschreibt, wie die entwickelte Methodik für die präzise Biofabrikation menschlicher neuronaler Konstrukte genutzt werden kann.
Zunächst werden Alginat-Mikropartikel, die als körnige Komponente in den SHAPE-Verbundwerkstoffen dienen, hergestellt und mit einer kollagenbasierten kontinuierlichen Komponente kombiniert. Dann werden menschliche neuronale Stammzellen in das Trägermaterial gedruckt, gefolgt vom Ausglühen des Trägers. Die gedruckten Konstrukte können wochenlang aufrechterhalten werden, um die Differenzierung der gedruckten Zellen zu Neuronen zu ermöglichen. Gleichzeitig ermöglicht die kontinuierliche Phase des Kollagens das axonale Wachstum und die Verbindung von Regionen. Schließlich liefert diese Arbeit Informationen darüber, wie Lebendzell-Fluoreszenzbildgebung und Immunzytochemie durchgeführt werden können, um die 3D-gedruckten menschlichen neuronalen Konstrukte zu charakterisieren.

Die Herstellung von Alginat-Mikrogelen durch Scherverdünnung während der internen Gelierung, gefolgt von mechanischer Fragmentierung, ergibt Alginat-Mikrogele, die polydispergiert und flockenartig geformt sind, wie in Abbildung 2G zu sehen ist. Die Größe dieser unregelmäßigen Partikel reicht von weniger als 1 μm bis zu einem Durchmesser von etwa 40 μm. Dicht gepackt bilden die Mikropartikel ein transparentes Schüttgut, das nur geringfügig undurchsichtiger ist als das entsp...

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Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für den Freiform-eingebetteten 3D-Druck von neuralen Stammzellen in selbstheilenden, annealbaren Partikel-extrazellulären Matrixkompositen. Das Protokoll ermöglicht die programmierbare Strukturierung von miteinander verbundenen menschlichen Nervengewebekonstrukten mit hoher Genauigkeit.

Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...

Der eingebettete 3D-Druck in SHAPE-Verbundwerkstoffen überwindet die traditionellen Einschränkungen der Biofabrikation und ermöglicht eine genaue Strukturierung von mechanisch empfindlichem Gewebe in Hydrogelen, die der nativen extrazellulären Umgebung ähneln. Die SHAPE Toolbox basiert auf einem modularen Biomaterialdesign, das einfache Änderungen in der Formulierung des Druckträgers ermöglicht. Es nutzt auch kostengünstige Materialien und zugängliche Geräte für eine einfache Anpassung durch andere Forschungsgruppen.Dieser Ansatz kann angewendet werden, um räumlich definierte menschliche neuronale Gewebemodelle zu erstellen, um die neuronale Entwicklung und Kommunikation bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Herstellung von Calciumcarbonatlösung in Reinstwasser mit einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter. Mischen Sie es mit der Alginatlösung in gleichem Verhältnis und rühren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 650 U/min magnetisch um.Fügen Sie dann dieser Mischung Essigsäure im Verhältnis eins zu 500 hinzu und rühren Sie erneut über Nacht. Am nächsten Tag wird die gelierte Alginatlösung bei 15.000 U/min mit einem Homogenisator 10 Minuten lang mechanisch in Mikropartikel zerkleinert. Zentrifugieren Sie dann, um die Mikropartikel zu erhalten.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie die Partikel im DMEM, die zwei millimolare Natronlauge und 1 % Penicillin-Streptomycin enthalten. Die Farbe der Aufhängung sollte sich wieder in Rot ändern. Inkubieren Sie die Suspension über Nacht bei vier Grad Celsius.Nach der Inkubation wird die Suspension drei Minuten lang bei 15.000 U/min homogenisiert und 10 Minuten lang bei 18.500 G zentrifugiert. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und beobachten Sie das Pellet auf dicht gepackte Alginat-Mikropartikel. Um das SHAPE-Komposit zu erzeugen, mischen Sie das Alginat-Mikropartikel-Pellet mit verdünntem und neutralisiertem Kollagen im Verhältnis zwei zu eins und pipettieren Sie es auf Eis auf und ab.Übertragen Sie das erzeugte Verbundmaterial in eine gekühlte 24-Well-Platte. Dissoziieren Sie vor dem Drucken die zuvor kultivierten humanen neuralen Stammzellen oder hNSCs mit einer 0,025%igen Trypsinlösung für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend neutralisieren Sie das Trypsin mit dem Wachstumsmedium und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei bis drei Milliliter Nährmedium. Laden Sie mit einer stumpfen Metallnadel von 21 Gauge 100 Mikroliter dicht gepackte Alginat-Mikropartikel in die Spritze. Anschließend wird die vorbereitete Zellsuspension in eine Spritze gefüllt.Ersetzen Sie zum Drucken die Ladenadel durch eine stumpfe Metallnadel mit 27 Gauge. Sobald die zu druckende Struktur entworfen wurde, klicken Sie unter Verwendung der referenzierten Software auf Generieren für eine G-Code-Generierung. Führen Sie die zellbeladene Spritze in einen volumetrischen Extrusionskopf auf einem extrusionsbasierten Bioprinter ein und notieren Sie die Nadellänge, indem Sie auf Nadellängenmessvorgang starten klicken.Legen Sie dann die mit SHAPE Composite bestückte 24-Well-Platte auf den Drucker und klicken Sie auf SHM, um die Höhe der leeren Well-Oberfläche zu messen. Wählen Sie pH 2 gefolgt vom Schraubenschlüsselsymbol. Ändern Sie dann unter dem Parametersatz den Volumenstrom auf 3,6 Mikroliter pro Sekunde und drücken Sie Parameter anwenden, gefolgt von Speichern und Fertig.Laden Sie den G-Code in die Benutzeroberfläche des Druckers, indem Sie auf ein Symbol zum Öffnen des G-Codes klicken. Wählen Sie das Symbol für das laufende Programm aus, um den Druckvorgang zu starten. Unmittelbar nach dem Druck wird das SHAPE-Gel bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten zum Ausglühen inkubiert.Geben Sie dann vorsichtig das Nährmedium auf den geglühten SHAPE-Gelträger. Entfernen Sie für die Immunfärbung das überschüssige Medium aus dem Gel und überführen Sie das Gel mit einem Spatel in einen Behälter mit DPBS. Sobald die Platte im Abzug platziert ist, entfernen Sie das DPBS.Bedecken Sie das Gel mit 4%iger Formaldehydlösung und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen mit DPBS die Blockierlösung in das Gel geben. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie sie sechs Stunden lang bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.Sobald die blockierende Lösung entfernt ist, fügen Sie den primären Antikörper dem Gel hinzu und rocken Sie es vorsichtig. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Behandeln Sie das Gel nach der DPBS-Wäsche 24 Stunden lang ebenfalls mit der sekundären Antikörperlösung.Geben Sie das gefärbte Gel vor der Bildgebung mit einem Spatel in eine Well-Platte mit einem dünnen Bildboden. In der vorliegenden Studie druckte die hNSC-Tinte ein Filament aus Zellen mit einem Durchmesser von etwa 200 Mikrometern. Die gedruckten Stränge waren reich an lebensfähigen Zellen mit einer umgebenden Morphologie.Nach 30 Tagen des Druckens zeigten die Zellen eine neuronale Morphologie mit kleinen Zellkörpern und langen, dünnen Fortsätzen, was auf die erfolgreiche Differenzierung von hNSCs hindeutete. Die Färbung mit Tubulin beta drei ermöglichte die Visualisierung der erzeugten neuronalen Netze bei gleichbleibender Geometrie. Und während des Differenzierungsprozesses wanderten die Zellen nicht aus den gedruckten Strängen heraus.SHAPE-Komposit kann verwendet werden, um perfusible Kanäle zu erzeugen, indem Opfertinte anstelle von Zellen gedruckt wird. Darüber hinaus kann der Träger sauerstoffempfindliche Kügelchen enthalten, um die Sauerstoffspannung in 3D-gedruckten Strukturen über Zeit und Raum zu überwachen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Forschung

Biotechnik

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...