Name: microgel-extracellular matrix composite support for the embedded 3d printing of human neural constructs
Uploaded: 2023-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs at JoVE.com

La investigación fue financiada principalmente por el Programa BrainMatTrain Horizon 2020 de la Unión Europea (No. H2020-MSCA-ITN-2015) bajo la Red de Formación Inicial Marie Skłodowska-Curie y el Acuerdo de Subvención No. 676408. C.R. y J.U.L. desean agradecer a la Fundación Lundbeck (R250-2017-1425) y al Fondo de Investigación Independiente de Dinamarca (8048-00050) por su apoyo. Agradecemos la financiación del proyecto HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.

1. Preparación de los tampones y reactivos
<ol><li>Preparar el medio de crecimiento celular añadiendo los siguientes suplementos a DMEM/F12 con L-alanil-L-glutamina dipéptido: 30 mM de glucosa, 5 μM de HEPES, 0,5% p/v de albúmina sérica bovina rica en lípidos, 40 μM L-alanina, 40 μM L-asparagina monohidrato, 40 μM de ácido L-aspártico, 40 μM de ácido L-glutámico, 40 μM L-prolina, 1% de suplemento N2, 1% de penicilina-estreptomicina y 20 ng/L de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y ...

<ol>
	<li>Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omnidirectional+printing+of+3D+microvascular+networks.">Omnidirectional printing of 3D microvascular networks.</a> Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).</li><li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Writing+in+the+granular+gel+medium.">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).</li><li>Skylar-Scott, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomanufacturing+of+organ-specific+tissues+with+high+cellular+density+and+embedded+vascular+channels.">Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels.</a> Science Advances. 5 (9), (2019).</li><li>Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+3D+printing+of+shear-thinning+hydrogels+into+self-healing+hydrogels.">Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Noor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+personalized+thick+and+perfusable+cardiac+patches+and+hearts.">3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts.</a> Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>LeBlanc, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+high+speed+3D+printing+in+liquid-like+solids.">Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).</li><li>Prendergast, M. E., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+modeling+and+experimental+characterization+of+extrusion+printing+into+suspension+baths.">Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).</li><li>Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+support+media+for+high+resolution+3D+printing+of+volumetric+cell-containing+ECM+structures.">Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures.</a> Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).</li><li>McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+in+suspension+baths:+Keeping+the+promises+of+bioprinting+afloat.">3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat.</a> Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).</li><li>Kajtez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+3D+printing+in+self-healing+annealable+composites+for+precise+patterning+of+functionally+mature+human+neural+constructs.">Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs.</a> Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).</li><li>Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlinked+macroporous+3D+scaffolds+from+microgel+rods.">Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+slurry+as+a+support+medium+for+bioprinting+and+culturing+freestanding+cell-laden+hydrogel+constructs.">Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).</li></ol>

El enfoque de material compuesto SHAPE proporciona una ruta versátil para la formulación de baños de soporte recocibles y biofuncionales para la impresión 3D incrustada de tintas celulares. Si bien este protocolo proporciona un ejemplo de la impresión 3D de construcciones neuronales, la caja de herramientas SHAPE podría adaptarse fácilmente a la biofabricación con otras fuentes celulares para la ingeniería precisa de una gama de tipos de tejidos objetivo. El enfoque de impresión también permitiría el patrón ...

La impresión 3D precisa y programable de construcciones de hidrogel cargadas de células que imitan los tejidos blandos in vitro presenta un gran desafío. Por ejemplo, los intentos basados en la extrusión directa de hidrogeles blandos son inherentemente problemáticos, ya que las pobres propiedades mecánicas requeridas para recapitular el microambiente in vivo conducen a una falta de integridad estructural, deformaciones de las características predefinidas o el colapso completo de las estructuras fabricadas. Una solución convencional para este problema es imprimir un andamio de soporte a partir de un material biocompatible más rígido que permita que la construcción final mantenga su forma. Sin embargo, este enfoque limita en gran medida las posibilidades de diseño y requiere un cuidadoso ajuste reológico de las tintas adyacentes.
Para superar las limitaciones de la impresión 3D tradicional basada en extrusión capa por capa, la impresión 3D integrada ha surgido en los últimos años como una poderosa alternativa para la fabricación de materiales blandos y tejidos 1,2,3,4,5,6. En lugar de extruir la tinta en el aire ambiente sobre una superficie, la tinta se deposita directamente a través de una aguja de jeringa dentro de un baño de soporte que es sólido en reposo, pero se fluidiza reversiblemente alrededor de la punta de la aguja en movimiento para permitir la deposición precisa de material cargado de células blandas. El material depositado se mantiene en su lugar a medida que el soporte se resolidifica en la estela de la aguja. Como tal, la impresión 3D integrada permite la fabricación de forma libre de alta resolución de estructuras intrincadas a partir de biomateriales blandos con posibilidades de diseño ampliadas 7,8.
Los geles granulares se han explorado ampliamente como materiales de baño de soporte para la impresión 3D integrada, ya que pueden formularse para exhibir transiciones suaves, localizadas y reversibles de sólido a líquido a bajas tensiones de rendimiento 9,10,11. Si bien muestran excelentes propiedades reológicas para la impresión de alta resolución, los geles granulares se han restringido a un puñado de biomateriales12. La falta de diversidad en las formulaciones de gel granular, que es particularmente evidente si se considera la amplia gama de biomateriales disponibles para formulaciones de hidrogel a granel, se debe a la necesidad de generar una gran cantidad de microgeles utilizando químicos simples. Debido al limitado panorama biomaterial de los soportes de gel granular, el ajuste del microambiente extracelular proporcionado por el soporte de impresión presenta un desafío en el campo.
Recientemente, se ha desarrollado un enfoque modular para la generación de soportes de impresión 3D integrados, denominados compuestos de matriz extracelular de partículas recibles autorreparables (SHAPE)13. Este enfoque combina las distintas propiedades reológicas de los geles granulares con la versatilidad biofuncional de las formulaciones de hidrogel a granel. El soporte compuesto SHAPE presentado consiste en micropartículas de alginato empaquetadas (fase granular, fracción de volumen ~70%) con un espacio intersticial aumentado lleno de una solución de pregel ECM a base de colágeno viscoso (fase continua, fracción de volumen ~30%). Además, se ha demostrado que el soporte SHAPE facilita la deposición de alta resolución de células madre neurales humanas (hNSC) que, después del recocido del baño de soporte, pueden diferenciarse en neuronas y mantenerse durante semanas para alcanzar la maduración funcional. La impresión 3D integrada dentro del baño de soporte SHAPE supera algunas de las principales limitaciones relacionadas con las técnicas convencionales para la biofabricación de tejidos neuronales al tiempo que proporciona una plataforma versátil.
Este trabajo detalla los pasos para la impresión 3D embebida de hNSCs dentro del soporte SHAPE y su posterior diferenciación en neuronas funcionales (Figura 1). En primer lugar, las micropartículas de alginato se generan mediante cizallamiento durante la gelificación interna. Este enfoque permite la fácil generación de grandes volúmenes de micropartículas sin necesidad de equipos especializados y reactivos citotóxicos. Además, el alginato es una fuente de material ampliamente disponible y económica para la formación de sustratos de hidrogel biocompatibles para una amplia gama de tipos de células. Las micropartículas de alginato generadas se combinan con una solución de colágeno para formar el material de soporte compuesto SHAPE. Luego, las hNSC se cosechan y se cargan en una jeringa como una biotinta celular para la impresión 3D. Una bioimpresora 3D se utiliza para la impresión integrada basada en extrusión de hNSC dentro del compuesto SHAPE. Las células impresas en 3D se diferencian en neuronas para dar lugar a construcciones neuronales humanas espacialmente definidas y funcionales. Finalmente, el protocolo describe cómo se pueden caracterizar las construcciones de tejido generado utilizando imágenes de células vivas e inmunocitoquímica. Además, se proporcionan consejos para la optimización y la solución de problemas. En particular, tanto los componentes de la fase granular como la continua podrían intercambiarse con otras formulaciones de hidrogel para acomodar diferentes restos biofuncionales, propiedades mecánicas y mecanismos de reticulación, según lo requerido por otros tipos de células y tejidos más allá de las aplicaciones neuronales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Gastight Syringe 1001 TLL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DDiscovery 3D bioprinter</td>
			<td>RegenHU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Goat anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Needle, Sterican (21 G)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9180109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Needle (27 G)</td>
			<td>Cellink</td>
			<td>NZ5270505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCAD software</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0853-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3718-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>212-GD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RET basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3622000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S25N-10G dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4447100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Alginate (80-120 cP)</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>194-13321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3720000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBB3 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801213</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthan gum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microgel-extracellular matrix composite support for the embedded 3d printing of human neural constructs

La impresión 3D integrada de células dentro de un medio de soporte granular ha surgido en la última década como un enfoque poderoso para la biofabricación de forma libre de construcciones de tejidos blandos. Sin embargo, las formulaciones de gel granular se han restringido a un número limitado de biomateriales que permiten la generación rentable de grandes cantidades de micropartículas de hidrogel. Por lo tanto, los medios de soporte de gel granular generalmente han carecido de las funciones adhesivas e instructivas celulares que se encuentran en la matriz extracelular nativa (ECM).
Para abordar esto, se ha desarrollado una metodología para la generación de compuestos de matriz extracelular de partículas recleables autorreparables (SHAPE). Los compuestos SHAPE consisten en una fase granular (microgeles) y una fase continua (solución ECM viscosa) que, juntas, permiten tanto la impresión programable de alta fidelidad como un entorno extracelular biofuncional ajustable. Este trabajo describe cómo se puede utilizar la metodología desarrollada para la biofabricación precisa de construcciones neuronales humanas.
En primer lugar, las micropartículas de alginato, que sirven como componente granular en los compuestos SHAPE, se fabrican y combinan con un componente continuo a base de colágeno. Luego, las células madre neurales humanas se imprimen dentro del material de soporte, seguido del recocido del soporte. Las construcciones impresas se pueden mantener durante semanas para permitir la diferenciación de las células impresas en neuronas. Simultáneamente, la fase continua de colágeno permite el crecimiento axonal y la interconexión de regiones. Finalmente, este trabajo proporciona información sobre cómo realizar imágenes de fluorescencia de células vivas e inmunocitoquímica para caracterizar las construcciones neuronales humanas impresas en 3D.

La preparación de microgel de alginato a través del adelgazamiento por cizallamiento durante la gelificación interna seguida de fragmentación mecánica produce microgeles de alginato que son polidispersos en tamaño y forma de escamas como se ve en la Figura 2G. El tamaño de estas partículas irregulares varía de menos de 1 μm a aproximadamente 40 μm de diámetro. Cuando están apretadas, las micropartículas forman un material a granel transparente que es solo ligeramente m...

Watch this Scientific Journal Video about Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs at JoVE.com

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

Este trabajo describe un protocolo para la impresión 3D incrustada de forma libre de células madre neurales dentro de compuestos de matriz extracelular de partículas recibles autocurables. El protocolo permite el patrón programable de construcciones de tejido neural humano interconectadas con alta fidelidad.

Soporte compuesto de matriz extracelular de microgel para la impresión 3D integrada de construcciones neuronales humanas

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...

La impresión 3D integrada dentro de los compuestos SHAPE supera las limitaciones tradicionales de biofabricación para permitir un patrón preciso de tejidos mecánicamente sensibles dentro de hidrogeles que se asemejan al entorno extracelular nativo. La caja de herramientas SHAPE se basa en el diseño modular de biomateriales, lo que permite cambios fáciles en la formulación del soporte de impresión. También aprovecha materiales de bajo costo y equipos accesibles para una simple adaptación por parte de otros grupos de investigación.Este enfoque se puede aplicar para crear modelos de tejido neural humano definidos espacialmente para examinar el desarrollo neuronal y la comunicación en trastornos neurodegenerativos como el Parkinson. Comience preparando una solución de carbonato de calcio en agua ultrapura a una concentración de dos miligramos por mililitro. Mezclarlo con la solución de alginato en una proporción igual y removerlo magnéticamente a 650 RPM durante una hora a temperatura ambiente.Luego agregue ácido acético a esta mezcla en una proporción de uno a 500 y revuelva nuevamente durante la noche. Al día siguiente, fragmente mecánicamente la solución de alginato gelatinado en micropartículas a 15, 000 RPM durante 10 minutos usando un homogeneizador. Luego centrifugar para obtener las micropartículas.Deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las partículas en el DMEM, que contiene dos hidróxido de sodio milimolar y estreptomicina al 1%. El color de la suspensión debe cambiar de nuevo a rojo. Incubar la suspensión durante la noche a cuatro grados centígrados.Después de la incubación, homogeneice la suspensión durante tres minutos a 15, 000 RPM y centrifugar a 18, 500 G durante 10 minutos. Después de centrifugar, retire el sobrenadante y observe el pellet en busca de micropartículas de alginato apretadas. Para generar el compuesto SHAPE, mezcle el pellet de micropartículas de alginato con colágeno diluido y neutralizado en una proporción de dos a uno y pipetearlo hacia arriba y hacia abajo en hielo.Transfiera el material compuesto generado a una placa enfriada de 24 pocillos. Antes de imprimir, disocie las células madre neurales humanas previamente cultivadas o hNSC utilizando una solución de tripsina al 0,025% durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Luego neutralizar la tripsina con el medio de crecimiento y centrifugar la suspensión celular a 400 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.Después de retirar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en dos o tres mililitros de medio de crecimiento. Usando una aguja de metal romo calibre 21, cargue 100 microlitros de micropartículas de alginato apretadas en la jeringa. Luego cargue la suspensión celular preparada en una jeringa.Para imprimir, reemplace la aguja de carga con una aguja de metal romo de calibre 27. Usando el software de referencia, una vez que se diseña la estructura a imprimir, haga clic en generar para una generación de código G. Inserte la jeringa cargada con células en un cabezal de extrusión volumétrica en una bioimpresora basada en extrusión y registre la longitud de la aguja haciendo clic en iniciar el proceso de medición de la longitud de la aguja.A continuación, coloque la placa de 24 pocillos cargada con el compuesto SHAPE en la impresora y haga clic en SHM para medir la altura de la superficie del pozo vacío. Seleccione pH 2 seguido del símbolo de llave inglesa. Luego, en el conjunto de parámetros, cambie el caudal volumétrico a 3.6 microlitros por segundo y presione Aplicar parámetro, seguido de Guardar y listo.Cargue el código G en la interfaz de usuario de la impresora haciendo clic en un icono para abrir el código G. Seleccione el icono del programa de ejecución para iniciar el procedimiento de impresión. Inmediatamente después de imprimir, incubar el gel SHAPE a 37 grados centígrados durante 30 minutos para recocido.A continuación, agregue suavemente el medio de crecimiento al soporte de gel SHAPE recocido. Para la inmunotinción, retire el exceso de medio del gel y, con una espátula, transfiera el gel a un recipiente que contenga DPBS. Una vez que la placa esté colocada en la campana extractora, retire el DPBS.Cubra el gel con una solución de formaldehído al 4% e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar con DPBS, agregue la solución de bloqueo al gel. Mece la placa suavemente e incuba durante seis horas a temperatura ambiente para evitar una unión inespecífica.Una vez que se retire la solución de bloqueo, agregue el anticuerpo primario al gel y sacuda suavemente. Incubar el plato durante 48 horas a cuatro grados centígrados. Después del lavado DPBS, trate de manera similar el gel con la solución de anticuerpos secundarios durante 24 horas.Coloque el gel teñido con una espátula en una placa de pocillo con un fondo de imagen delgado antes de obtener imágenes. En el presente estudio, la tinta hNSC imprimió un filamento de células con un diámetro de alrededor de 200 micrómetros. Las hebras impresas eran ricas en células viables con morfología alrededor.Después de 30 días de impresión, las células exhibieron morfología neural con cuerpos celulares pequeños y procesos largos y delgados, lo que indicó la diferenciación exitosa de hNSC. La tinción con tubulina beta tres permitió la visualización de las redes neuronales generadas con geometría mantenida. Y durante el proceso de diferenciación, las células no migraron fuera de las hebras impresas.El compuesto SHAPE se puede utilizar para producir canales perfusibles imprimiendo tinta de sacrificio en lugar de celdas. Además, el soporte puede incluir perlas sensibles al oxígeno para monitorear la tensión de oxígeno en estructuras impresas en 3D a lo largo del tiempo y el espacio.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Investigación

Bioingeniería

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Todo el cuerpo de Espectrometría de Masas de imágenes por infrarrojos asistida por matriz de desorción láser de ionización electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Novedoso proceso para la impresión 3D Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Medición de metaloproteinasa de la matriz celular Global y actividad metabólica en hidrogeles 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Impresión 3D de microportadores de hidrogel in vitro mediante chorro de fuerza viscoso-inercial alternado

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...