Name: A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-10-20T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה הצ'כית למדעים RVO 68378050, LM2018126 המרכז הצ'כי לפנוגנומיקה שסופק על ידי MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (שדרוג המרכז הצ'כי לפנוגנומיה: פיתוח לקראת מחקר תרגום על ידי MEYS ו- ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II by MEYS ו- ESIF), ו- OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (איכות וקיבולת גבוהות יותר למודלים טרנסגניים על ידי MEYS ו- ERDF). בנוסף, מחקר זה קיבל מימון מהארגון הלא ממשלתי "האגודה לריפוי גנטי (ASGENT)", צ'כיה (https://asgent.org/) והמרכז הצ'כי LM2023036 לפנוגנומיקה המסופקים על ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של הרפובליקה הצ'כית.

כל בעלי החיים והניסויים ששימשו במחקר זה עברו בדיקה אתית ונערכו בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU. המחקר אושר על ידי הוועדה המרכזית הצ'כית לרווחת בעלי חיים. עכברים שוכנו בכלובים מאווררים בנפרד והוחזקו בטמפרטורה קבועה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס עם מחזור אור / חושך של 12 שעות. העכברים קיבלו צ'או עכבר ומ...

Validating a Murine Model of Angelman Syndrome Using Behavioral Tests

מודלים שנוצרו בזני מורין שונים מאומתים בדרך כלל עם בדיקות של מצב רגשי של בעלי חיים, תפקודים מוטוריים ויכולות קוגניטיביות כדי להקל על השוואה לסימפטומים אנושיים31,32. ליקוי מוטורי במודלים של AS הוא הממצא העקבי ביותר במעבדות, ואחריו מצב רגשי ללא שינוי של מוטנטים ...

תסמונת אנג'למן (AS) היא מחלה נוירו-התפתחותית נדירה. המקור הגנטי הנפוץ ביותר של AS הוא מחיקה גדולה של אזור 15q11-q13 של הכרומוזום שמקורו באם, שנמצא בכמעט 74% מהחולים1. מחיקה של אזור זה גורמת לאובדן של UBE3A, הגן הסיבתי העיקרי של AS המקודד E3 ubiquitin ligase. האלל האבהי של הגן UBE3A בתאי עצב מושתק בתהליך המכונה הטבעה. כתוצאה מכך, הטבעה אבהית של הגן מאפשרת ביטוי אימהי בלבד במערכת העצבים המרכזית (CNS)2. לכן, מחיקת גן UBE3A מכרומוזום שמקורו באם מובילה להתפתחות תסמיני AS. בבני אדם, AS מתבטא בסביבות גיל 6 חודשים, עם פיגור התפתחותי שנמשך לאורך כל שלבי ההתפתחות וגורם לתסמינים מתישים חמורים אצל אנשים מושפעים 3,4. תסמיני הליבה של ההפרעה כוללים את הגירעון של מיומנויות מוטוריות עדינות וגסות, כולל הליכה אטקסית קופצנית, ליקוי דיבור חמור ונכות אינטלקטואלית. כ-80% מחולי AS סובלים גם מהפרעות שינה ואפילפסיה. נכון להיום, הטיפול הזמין היחיד הוא תרופות סימפטומטיות, המפחיתות התקפים אפילפטיים ומשפרות את איכות השינה1. לכן, פיתוח מודלים חזקים של בעלי חיים עם פנוטיפים התנהגותיים הניתנים לשחזור לצד ניתוח פנוטיפ מעודן יהיה חיוני כדי להבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של ההפרעה ולגלות תרופות וטיפולים יעילים.
המורכבות של ההפרעה האנושית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית דורשת מאורגניזמי המודל להיות בעלי גנום, פיזיולוגיה והתנהגות דומים. עכברים פופולריים כאורגניזם מודל בשל מחזור הרבייה הקצר שלהם, גודלם הקטן והקלות היחסית של שינוי DNA. בשנת 1984 הציע פול וילנר שלושה קריטריונים בסיסיים לאימות מודל המחלה: מבנה, פנים ותוקף ניבוי, המשמשים לקביעת ערךהמודל 5. בפשטות, תוקף המבנה משקף את המנגנונים הביולוגיים האחראים להתפתחות ההפרעה, תוקף הפנים משחזר את הסימפטומים שלה, ותוקף הניבוי מתאר את תגובת המודל לתרופות טיפוליות.
כדי לדבוק בעקרונות לעיל, בחרנו באטיולוגיה הגנטית הנפוצה ביותר, מחיקה גדולה של מוקד 15q11.2-13q האימהי כולל הגן UBE3A, כדי ליצור עכברי מודל AS. השתמשנו בטכניקת CRISPR/Cas9 כדי למחוק אזור באורך 76,225 bp המשתרע על פני כל הגן UBE3A, ומקיף הן את רכיבי הקידוד והן את האלמנטים שאינם מקודדים של הגן, בעכברים מרקע C57BL/6N6. לאחר מכן גידלנו את החיות כדי להשיג עכברים הטרוזיגוטיים מסוג UBE3A+/−. לצורך אימות פנים של המודל, השתמשנו בבעלי חיים מצלבים של נקבות UBE3A+/− וזכרים מסוג בר כדי להשיג צאצאי UBE3A+/- (זן בשם C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph ומאוחר יותר הוקצה כ-UBE3A mGenedel/+) ולשלוט בהמלטות. בדקנו את המוטוריקה העדינה והגסה שלהם, את הרגשנות ואת ההשפעה שלהם כדי לשחזר את תסמיני הליבה AS. במאמר קודם הערכנו גם את התפקודים הקוגניטיביים של בעלי החיים, שכן חולי AS סובלים גם מלקות אינטלקטואלית6. עם זאת, לא מצאנו ליקויים קוגניטיביים בעכברי UBE3AmGenedel/+, אולי בגלל גילם הצעיר של בעלי החיים בזמן הבדיקה7. בחינה מאוחרת יותר של בעלי החיים המבוגרים יותר, בסביבות גיל 18 שבועות, גילתה ליקוי בגמישות התנהגותית במהלך למידה היפוכה בפרדיגמת העדפת המקום. עם זאת, המורכבות של הציוד המועסק לניתוח זה דורשת מודול מתודולוגי נפרד והוא אינו נכלל כאן.
המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כאן שייכים לכלי הפנוטיפ הנפוצים במחקר גנטי, הודות לערך הניבוי הגבוה שלהם ותוקף המבנה המספיק 8,9,10. השתמשנו בבדיקות אלה כדי לאמת מודל עכברי של AS על ידי סיכום תסמיני הליבה של המחלה האנושית באופן שניתן לשחזר ואינו תלוי בגיל. הרגשנות של החיה הוערכה במבוך פלוס מוגבה ובמבחני שדה פתוחים. שני הניסויים הללו מבוססים על קונפליקט גישה-הימנעות, שבו בעלי חיים חוקרים סביבה חדשה בחיפוש אחר מזון, מחסה או הזדמנויות הזדווגות, ובו בזמן נמנעים ממדורים חרדתיים11. בנוסף, מבחן השדה הפתוח משמש לבדיקת פעילות לוקומוטוריתשל עכבר 8. מבחן מתלה הזנב נמצא בשימוש נרחב במחקר דיכאון כדי לסנן תרופות נוגדות דיכאון חדשות או פנוטיפים דמויי דיכאון במודלים נוקאאוט עכבר12. מבחן זה מעריך את הייאוש שבעלי חיים מפתחים לאורך זמן במצב שאין מנוס ממנו. למידה מוטורית ומאפייני הליכה מפורטים נקבעו על הרוטרוד וב- DigiGait, בהתאמה. סיבולת בעלי חיים על המוט המאיץ מאפיינת את כישורי שיווי המשקל ותיאום התנועה שלו, בעוד ניתוח מפורט של דפוסי הצעדים של העכבר הוא הערכה רגישה של ליקויים עצביים-שריריים הקשורים להפרעות תנועה נוירוגנרטיביות רבות13,14,15. בדיקת גריסת הקן היא חלק מהמתודולוגיה הסטנדרטית לאיתור התנהגות אימפולסיבית במכרסמים, ומכיוון שהיא משתמשת בהתנהגות טבעית של בניית מכרסמים, היא מעידה על רווחת בעל החיים16,17.
גודלן של קבוצות הניסוי היה תוצאה של פשרה כדי לעמוד בדרישות חוק 3R ושימוש יעיל בביצועי הרבייה של המושבות. עם זאת, כדי להשיג כוח סטטיסטי, היו לקבוצות לא פחות מ -10 פרטים, בשל הקמת כמות מספקת של זוגות רבייה. למרבה הצער, ביצועי הרבייה לא תמיד הביאו למספר מספיק של בעלי חיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cages, individually ventilated</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGait</td>
			<td>Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level 
			Unit 110 
			Framingham, MA 01701, USA</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA Nestlet squares</td>
			<td>Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK</td>
			<td>Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.</td>
			<td>Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse chow</td>
			<td>Altramion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotarod</td>
			<td>TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 
			12489 Berlin, Germany</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Suspension Test</td>
			<td>Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles 
			FRANCE</td>
			<td>Reference: BIO-TST5</td>
			<td>Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore medical tape</td>
			<td>Medical M, Ltd.</td>
			<td>P-AIRO1291</td>
			<td>The tape used to attach an animal to the hook by its tail.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewer - Video Tracking System</td>
			<td>Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 
			53111 Bonn, Germany</td>
			<td>Equipment with software were tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,&#160; 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral characterization of an angelman syndrome mouse model

כתב יד זה מתאר סוללה של מבחנים התנהגותיים הזמינים כדי לאפיין פנוטיפים דמויי תסמונת אנג'למן (AS) במודל מוריני מבוסס של AS. אנו משתמשים בפרדיגמת הלמידה של רוטרוד, ניתוח הליכה מפורט ומבחן בניית קן כדי לזהות ולאפיין ליקויים מוטוריים של בעלי חיים. אנו בודקים רגשנות של בעלי חיים בשדה הפתוח ובמבחני מבוך מוגבהים פלוס, כמו גם את ההשפעה במבחן מתלה הזנב. כאשר עכברי AS נבדקים במבחן השדה הפתוח, יש לפרש את התוצאות בזהירות, שכן תפקוד מוטורי לקוי משפיע על התנהגות העכבר במבוך ומשנה את ציוני הפעילות.
יכולת השחזור והיעילות של המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כבר אומתו במספר קווי עכבר עצמאיים של Uba3a עם גרסאות נוקאאוט שונות, וביססו קבוצה זו של בדיקות ככלי אימות מצוין במחקר AS. מודלים עם המבנה הרלוונטי ותוקף הפנים יצדיקו חקירות נוספות כדי להבהיר את הפתופיזיולוגיה של המחלה ולהעניק פיתוח של טיפולים סיבתיים.

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

מבוך מוגבה פלוס ומבחני שדה פתוח בדיקות EPM ו- OF משתמשות בנטייה הטבעית של מכרסמים לחקור סביבות חדשות18,19. החקירה נשלטת על ידי קונפליקט גישה-הימנעות, שבו מכרסמים בוחרים בין חקר סביבה חדשה לבין הימנעות מסכנה אפשרית. בעלי חיים חוקרים מקומות לא ידועים בח?...

Watch this Scientific Journal Video about A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model at JoVE.com

A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model (Video) | JoVE

כתב יד זה מציג סדרה של מבחנים התנהגותיים הניתנים לשחזור כדי לאמת מודל עכבר של תסמונת אנג'למן.

אפיון התנהגותי של מודל עכבר תסמונת אנג'למן

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...

מטרתנו היא להבהיר את התפקידים הפיזיולוגיים של גנים באמצעות עכברים כמודל ניסויי. אנו מתמקדים גם בפיתוח מודלים עכבריים של מחלות ספציפיות שמדענים יכולים להשתמש בהם כדי לחקור סיבתיות למחלות ולפתח טיפולים יעילים. דוגמה לפעילות כזו היא מודל העכבר של תסמונת אנג'למן.ניתן לטעון כי הטכנולוגיה החדשה והמבטיחה ביותר בעלת הפוטנציאל היא שילוב בינה מלאכותית המבוססת על טכניקות למידה עמוקה במחקר בבעלי חיים. גישה זו יכולה לשמש לניטור ישיר של התנהגות בעלי החיים בכלוב הביתי ללא צורך שהנסיין יפריע לבעלי החיים. האתגר הגדול ביותר במחקרים התנהגותיים כיום הוא יכולת השחזור.לכן, אנו מציגים סוללה של בדיקות המאמתות את תסמונת אנג'למן של המודל באופן שאינו תלוי בגיל המודל או במין. אנו משתמשים במבחנים התנהגותיים מבוססים כדי לאמת את מודל AS שלנו. עם זאת, עם הגישה החדשנית לפיתוח המודל דומה מאוד למצב האנושי עם מחיקה גדולה.באמצעות טכנולוגיית CRISPR מחקנו את כל הגן UBE3A מהגנום של העכבר. בניגוד לדגמים אחרים שבהם המחיקה מוגבלת ל-3KB. אנחנו עובדים על פיתוח טיפול גנטי שיוכל לשחזר סימפטומים במודל עכבר.

Research

JoVE Journal