Name: Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-02-24T13:30:00
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Os autores agradecem à equipe da Divisão de Apoio à Pesquisa Médica, do Centro de Apoio à Pesquisa Avançada (ADRES) e aos membros da Divisão de Fisiopatologia Integrativa, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, por sua assistência técnica e apoio útil. Este estudo foi apoiado em parte pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI concede JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (para NS) e JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (para YI); subsídios da Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (para NS); e uma bolsa de pesquisa médica da Takeda Science Foundation, uma bolsa de projeto da UCB Japan (UCBJ) e a bolsa JSBMR Frontier Scientist 2019 (para YI).

Experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Ehime e foram realizados de acordo com as Diretrizes da Universidade de Ehime para Experimentos com Animais (37A1-1*16).
1. Preparação de instrumentos, reagentes e meio de cultura
<ol><li>Preparar o meio de cultura da seguinte forma: suplementar o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução antibiótico-antimicóti...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

<ol>
	<li>Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheumatoid+arthritis.">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).</li><li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis.">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).</li><li>Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+tissue+macrophages:+friend+or+foe.">Synovial tissue macrophages: friend or foe.</a> RMD Open. 3 (2), (2017).</li><li>Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+macrophages:+from+ordinary+eaters+to+extraordinary+multitaskers.">Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers.</a> Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).</li><li>Alivernini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+synovial+tissue+macrophage+subsets+regulate+inflammation+and+remission+in+rheumatoid+arthritis.">Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis.</a> Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).</li><li>Saeki, N., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+synovial+macrophage+metabolism+by+synovial+fibroblasts+under+inflammatory+conditions.">Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).</li><li>Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+normal+and+arthritogenic+murine+synovial+fibroblasts.">A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts.</a> Protocol Exchange. , (2009).</li><li>Saeki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulator+UHRF1+orchestrates+proinflammatory+gene+expression+in+rheumatoid+arthritis+in+a+suppressive+manner.">Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).</li><li>Midwood, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+is+an+endogenous+activator+of+Toll-like+receptor+4+that+is+essential+for+maintaining+inflammation+in+arthritic+joint+disease.">Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease.</a> Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).</li><li>You, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+engineered+stem+cell-derived+exosomes+to+regulate+macrophage+heterogeneity+in+rheumatoid+arthritis.">Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis.</a> Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).</li><li>Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+propagation+method+for+resident+macrophages+by+co-culture+and+subculture,+and+their+isolation+from+various+organs.">Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs.</a> BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).</li><li>Andr&#228;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+T-cell+functionality+after+flow+cytometry+sorting+revealed+p38+MAPK+activation.">An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).</li><li>Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheath+fluid+impacts+the+depletion+of+cellular+metabolites+in+cells+afflicted+by+sorting+induced+cellular+stress+(SICS).">Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS).</a> Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).</li><li>Llorente, I., Garc&#237;a-Casta&#241;eda, N., Valero, C., Gonz&#225;lez-&#193;lvaro, I., Casta&#241;eda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoporosis+in+rheumatoid+arthritis:+dangerous+liaisons.">Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons.</a> Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).</li><li>Croft, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+subsets+drive+inflammation+and+damage+in+arthritis.">Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis.</a> Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).</li><li>Wei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+drives+synovial+fibroblast+identity+and+arthritis+pathology.">Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology.</a> Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).</li></ol>

Este método aqui desenvolvido aprimora técnicas anteriores para isolar tanto as FS de artrite murina quanto os macrófagos residentes de vários órgãos7,11. O método modificado pode isolar macrófagos e fibroblastos da sinóvia inflamatória com alta pureza, sendo simples e reprodutível. Como o método não requer instrumentos complexos, como um classificador de células, qualquer pessoa pode conduzi-lo. Além disso, a presente técnica evita preocupações...

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por hiperplasia da sinóvia, levando à destruiçãoarticular1,2. Macrófagos e fibroblastos residentes no tecido estão presentes na sinóvia saudável para manter a homeostase articular. Em pacientes com AR, fibroblastos sinoviais (FSs) proliferam e células imunes, incluindo monócitos, infiltram-se na sinóvia e no fluido articular, processos associados à inflamação 1,3,4. Macrófagos sinoviais (SMs), que incluem macrófagos residentes e macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico, e SFs são aberrantemente ativados e têm papéis importantes na patogênese da AR. Estudos recentes têm sugerido que as interações célula-célula entre SMs e SFs contribuem tanto para a exacerbação quanto para a remissão da AR 5,6.
Para entender a patogênese da AR, vários modelos de artrite inflamatória em roedores têm sido usados, incluindo artrite de transferência sérica de K/BxN, artrite induzida por colágeno e artrite induzida por anticorpos de colágeno. Ensaios baseados em células são geralmente necessários para esclarecer as funções moleculares na artrite. Portanto, células primárias de modelos animais de artrite foram isoladas. O método para isolar as FS do tecido da artrite murina está bem estabelecido, e essas células têm contribuído para a elucidação de mecanismos moleculares na patogênese da artrite7,8. Por outro lado, macrófagos derivados da medula óssea, macrófagos derivados de monócitos sanguíneos e linhagens celulares de macrófagos têm sido frequentemente utilizados como recursos de macrófagos para estudos deartrite9,10. Uma vez que os macrófagos podem adquirir funções associadas ao seu microambiente, fontes gerais de macrófagos podem carecer de respostas específicas ao tecido da artrite. Além disso, é difícil obter células sinoviais suficientes por triagem, pois a sinóvia murina é um tecido muito pequeno, mesmo em modelos de artrite. A falta de uso de macrófagos sinoviais para estudos in vitro tem sido uma limitação em estudos de artrite. O estabelecimento de um protocolo para isolar e expandir macrófagos sinoviais seria uma vantagem para a elucidação dos mecanismos patológicos na AR.
No método anterior de isolamento das FS, os SMs eram descartados7. Além disso, foi relatado um método para isolar e expandir macrófagos residentes de alguns órgãos11. Portanto, os protocolos existentes foram modificados em combinação. A modificação visa atingir o cultivo primário de SMs e SFs com alta pureza. O objetivo geral deste método é isolar e expandir tanto SMs e SFs do tecido da artrite murina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35556-44</td>
			<td>Diluted with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic&#8211;antimycotic (anti/anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SV-23DLK</td>
			<td>23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>40 &#181;m pore, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellmatrix Type I-C</td>
			<td>Nitta gelatin</td>
			<td>637-00773</td>
			<td>Type I-C collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge tube 15</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91014</td>
			<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centriguge tube 50</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from C. Histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td>Type IV collagenase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>SIGAM</td>
			<td>173012</td>
			<td>Heat inactivation was performed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>PRI28-1525A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 40</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 60</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>KFI</td>
			<td>1-9749-31</td>
			<td>Fine-point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>PRI28-1522</td>
			<td>Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Stemi 305</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>STEMI305-EDU</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary synovial macrophages and fibroblasts from murine arthritis tissue

A artrite reumatoide é uma doença autoimune que leva à inflamação crônica das articulações. Macrófagos sinoviais e fibroblastos sinoviais têm papel central na patogênese da artrite reumatoide. É importante compreender as funções de ambas as populações celulares para revelar os mecanismos subjacentes à progressão patológica e remissão na artrite inflamatória. Em geral, as condições experimentais in vitro devem mimetizar ao máximo o ambiente in vivo . Células derivadas de tecidos primários têm sido utilizadas em experimentos caracterizando fibroblastos sinoviais em artrite. Em contraste, em experimentos investigando as funções biológicas de macrófagos em artrite inflamatória, linhagens celulares, macrófagos derivados da medula óssea e macrófagos derivados de monócitos sanguíneos têm sido usados. No entanto, não está claro se tais macrófagos realmente refletem as funções dos macrófagos residentes no tecido. Para a obtenção de macrófagos residentes, protocolos prévios foram modificados para isolar e expandir macrófagos primários e fibroblastos do tecido sinovial em um modelo de artrite inflamatória em camundongos. Essas células sinoviais primárias podem ser úteis para a análise in vitro da artrite inflamatória.

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Camundongos C57BL/6 fêmeas com 7-8 semanas de idade foram submetidos à artrite induzida por anticorpos de colágeno. Células semelhantes a macrófagos e fibroblastos foram isoladas independentemente do tecido inflamatório da artrite, de acordo com o procedimento descrito acima (Figura 2A,B). Células semelhantes a macrófagos foram utilizadas imediatamente após o passo 5.7. Células semelhantes a fibroblastos foram inicialmente cultivadas para serem subconfluentes após...

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Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

O presente estudo fornece um protocolo modificado para isolar macrófagos sinoviais e fibroblastos do tecido da artrite inflamatória murina.

Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

Ensaios baseados em células são necessários para esclarecer as funções moleculares. Em estudos de artrite, o método para isolar células primárias está bem estabelecido em fibroblastos sinoviais, mas não em macrófagos sinoviais. Portanto, desenvolvemos um protocolo para isolar e expandir macrófagos sinoviais e fibroblastos sinoviais de modelos de artrite.Fibroblastos sinoviais primários do tecido da artrite murina têm contribuído para a elucidação de mecanismos moleculares na patogênese da artrite. Por outro lado, macrófagos derivados da medula óssea, macrófagos derivados de monócitos sanguíneos e linhagens celulares de macrófagos têm sido frequentemente utilizados como recursos de macrófagos para estudos de artrite. Uma vez que os macrófagos podem adquirir funções associadas ao seu microambiente, fontes gerais de macrófagos podem carecer de respostas específicas ao tecido da artrite.Além disso, é difícil obter células sinoviais suficientes por triagem, pois a sinóvia murina é um tecido muito pequeno, mesmo em modelos de artrite. No método anterior de isolamento de fibroblastos sinoviais, macrófagos sinoviais foram descartados. Além disso, um método para isolar e expandir macrófagos residentes de alguns órgãos foi relatado.Portanto, os protocolos existentes foram modificados em combinação para isolar e expandir macrófagos sinoviais e fibroblastos sinoviais do tecido da artrite murina. Este método pode isolar macrófagos e fibroblastos da sinóvia inflamatória com alta pureza, sendo simples e reprodutível. Este método permite a expansão de macrófagos sinoviais sob co-cultura com fibroblastos sinoviais.Além disso, o método oferece uma vantagem, na medida em que os fibroblastos sinoviais podem ser usados com menos passagens. O protocolo estabelecido seria uma vantagem para a elucidação dos mecanismos patológicos na artrite reumatoide.