Name: a workflow for lipid nanoparticle (lnp) formulation optimization using designed mixture-process experiments and self-validated ensemble models (svem)
Uploaded: 2023-08-18T14:35:00
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代表性结果部分中描述的实验是根据实验动物护理和使用指南进行的，程序按照我们的机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南进行。商业获得6-8周龄雌性Balb / C小鼠。动物 随意接受 标准食物和水，并在标准条件下饲养12小时光照/黑暗循环，温度为65-75°F（~18-23°C），湿度为40-60%。
1. 记录研究目的、反应和因素
注意：在整个实验?...

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用于设计和分析混合过程实验的现代软件使科学家能够在结构化工作流程中改进其脂质纳米颗粒配方，从而避免低效的OFAT实验。最近开发的VEM建模方法消除了许多晦涩难懂的回归修改和模型缩减策略，这些修改和模型缩减策略以前可能会因无关的统计考虑而分散科学家的注意力。收集结果后，SVEM分析框架提供了一种方法，该方法更易于实施，并且倾向于生成比传统建模方法更好的模型<sup class="xr...

用于体内基因递送系统的脂质纳米颗粒（LNP）制剂通常涉及来自可电离脂质、辅助脂质和PEG脂质1，2，3类别的四种组成脂质。无论这些脂质是单独研究还是与其他非混合因子同时研究，这些配方的实验都需要“混合物”设计，因为 - 给定候选配方 - 增加或减少任何一种脂质的比例必然导致其他三种脂质的比例之和相应减少或增加。
为了说明这一点，假设我们正在优化LNP配方，该配方目前使用将被视为基准的固定配方。目标是最大限度地提高LNP的效力，其次是最小化平均粒径。实验中变化的研究因素是四种组成脂质（可电离、胆固醇、涂料、PEG）的摩尔比、N：P 比、流速和可电离脂质类型。可电离和辅助脂质（包括胆固醇）允许在比PEG更宽的摩尔比范围内变化，10-60%，在本图中将在1-5%之间变化。基准配方配方和其他因素的范围及其舍入粒度在补充文件 1 中指定。在这个例子中，科学家们能够在一天内进行23次运行（独特的颗粒批次），如果满足最低要求，他们希望将其用作样本量。该实验的模拟结果在补充文件2和补充文件3中提供。
Rampado和Peer4最近发表了一篇关于优化纳米颗粒药物输送系统的设计实验的综述论文。Kauffman等人5考虑了使用分数阶乘和确定性筛选设计进行LNP优化研究6;然而，如果不使用低效的“松弛变量”7，这些类型的设计就无法适应混合约束，并且通常在存在混合因子时不使用7，8。相反，能够包含混合约束的“最佳设计”传统上用于混合过程实验9。这些设计针对研究因子的用户指定函数，并且仅当该函数捕获研究因子和响应之间的真实关系时，这些设计才是最优的（在多种可能意义上的一种）。请注意，案文中对“最佳设计”和“最佳候选配方”有区别，后者是指由统计模型确定的最佳配方。对于混合过程实验，优化设计有三个主要缺点。首先，如果科学家在指定目标模型时未能预测研究因素的相互作用，那么得到的模型将是有偏差的，并可能产生较差的候选公式。其次，最优设计将大部分游程置于因子空间的外部边界上。在LNP研究中，如果颗粒在脂质或工艺设置的任何极端情况下没有正确形成，这可能会导致大量的运行损失。第三，科学家通常更喜欢在因子空间的内部进行实验运行，以获得与模型无关的响应面感，并直接在因子空间的先前未探索的区域观察该过程。
另一种设计原则是使用空间填充设计10来针对（混合约束）因子空间的近似均匀覆盖。相对于最优设计9 ，这些设计牺牲了一些实验效率（假设整个因子空间导致有效的公式），但在权衡中提供了一些好处，这些好处在本应用中很有用。空间填充设计不对响应面的结构做出任何 先验 假设;这使其能够灵活地捕获研究因素之间的意外关系。这也简化了设计生成，因为它不需要在调整所需的运行大小时决定添加或删除哪些回归项。当某些设计点（配方）导致公式失败时，空间填充设计可以对研究因子的失效边界进行建模，同时还支持成功因子组合上研究响应的统计模型。最后，因子空间的内部覆盖允许对响应面进行独立于模型的图形探索。
为了可视化混合过程实验的混合因子子空间，使用了专门的三角形“三元图”。 图 1 激发了这种用法：在允许三个成分范围从 0 到 1 的点立方体中，满足成分总和等于 1 的约束的点以红色突出显示。对三种成分的混合约束将可行因子空间减小为三角形。在具有四种混合物成分的LNP应用中，我们通过一次绘制两种脂质与代表其他脂质之和的“其他”轴来生成六种不同的三元图来表示因子空间。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65200/65200fig01.jpg"> 图 1：三角因子区域。 在立方体内的空间填充图中，灰色小点表示与混合约束不一致的配方。较大的红点位于立方体内的三角形上，表示满足混合约束的公式。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65200/65200fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
除了脂质混合物因子外，通常还有一个或多个连续的过程因子，例如N：P比，缓冲液浓度或流速。可能存在分类因子，例如可电离脂质类型、辅助性脂质类型或缓冲液类型。目标是在 体内 研究中找到一种配方（脂质和过程因子设置的混合物），以最大限度地提高某种效力和/或改善理化特性，例如最小化粒径和PDI（多分散指数），最大化包封百分比，并最大限度地减少副作用 - 例如体重减轻。即使从合理的基准配方开始，鉴于遗传有效载荷的变化或考虑过程因素或脂质类型的变化，也可能有兴趣重新优化。
康奈尔7提供了关于混合物和混合物过程实验的统计方面的权威文本，Myers等人9提供了最相关的混合物设计和优化分析主题的出色总结。然而，这些工作可能会使科学家负担过重的统计细节和专业术语。用于实验设计和分析的现代软件提供了一个强大的解决方案，可以充分支持大多数LNP优化问题，而不必诉诸相关理论。虽然更复杂或高优先级的研究仍将受益于与统计学家的合作，并可能采用最佳而不是空间填充设计，但我们的目标是提高科学家的舒适度，并鼓励优化LNP配方，而不是诉诸低效的一次单因素（OFAT）测试11或简单地满足规格的第一个配方。
在本文中，介绍了一种利用统计软件优化通用LNP配方问题的工作流程，按照遇到的顺序解决设计和分析问题。事实上，该方法适用于一般优化问题，不限于LNP。 在此过程中，解决了出现的几个常见问题，并根据经验和仿真结果提供了建议12。最近开发的自验证集成模型框架（SVEM）13 极大地改进了分析混合过程实验结果的脆弱方法，我们使用这种方法为配方优化提供了简化的策略。虽然工作流程的构建方式一般，可以使用其他软件包进行，但JMP 17 Pro的独特之处在于提供SVEM以及图形汇总工具，我们发现这些工具对于简化混合过程实验的晦涩分析是必要的。因此，协议中还提供了JMP特定的指令。
SVEM采用与传统方法相同的线性回归模型基础，但它允许我们使用前向选择或惩罚选择（Lasso）基本方法避免拟合候选效应的“完整模型”所需的繁琐修改。此外，SWEM提供了改进的“简化模型”拟合，可最大程度地减少合并数据中出现的噪声（过程加分析方差）的可能性。它的工作原理是平均模型13，14，15，16，17，18 中每次游程的相对重要性后产生的预测模型。SVEM提供了一个用于模拟混合过程实验的框架，该框架比传统的单次回归更容易实施，并且可以产生更高质量的最佳候选配方12，13。SVEM的数学细节超出了本文的范围，即使是超出相关文献综述的粗略总结也会分散其在本应用中的主要优势：它允许从业者简单，强大和准确的点击运行程序。
所提出的工作流程与药物开发的质量源于设计（QbD）19 方法一致20。研究结果将是了解将材料属性和工艺参数与关键质量属性（CQA）联系起来的功能关系21。Daniel等人22 讨论了使用专门用于RNA平台生产的QbD框架：我们的工作流程可以用作该框架内的工具。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>JMP Pro 17.1</td>
			<td>JMP Statistical Discovery LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a workflow for lipid nanoparticle (lnp) formulation optimization using designed mixture-process experiments and self-validated ensemble models (svem)

我们提出了一种质量源于设计（QbD）风格的方法来优化脂质纳米颗粒（LNP）配方，旨在为科学家提供可访问的工作流程。这些研究中的固有限制是可电离脂质、辅助脂质和PEG脂质的摩尔比必须加起来达到100%，需要专门的设计和分析方法来适应这种混合物约束。我们专注于LNP设计优化中常用的脂质和过程因子，通过采用空间填充设计和利用最近开发的自验证集成模型（SVEM）统计框架，提供了避免传统上在混合过程实验的设计和分析中出现的许多困难的步骤。除了生成候选最佳公式外，该工作流程还构建拟合统计模型的图形摘要，以简化结果的解释。新确定的候选配方通过确认运行进行评估，并且可以选择在更全面的第二阶段研究背景下进行。

这种方法已在两种广泛分类的脂质类型中得到验证：MC3样经典脂质和类脂质（例如，C12-200），通常来自组合化学。与使用一次一个因子（OFAT）方法开发的基准LNP配方相比，通过我们的工作流程生成的候选配方经常在对数尺度上显示出4至5倍的效力提高，如图 18中的小鼠肝荧光素酶读数所示。 表1 描述了在两个优化阶段（初始研究和后续研究）中，在基准对照性?...

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A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM

该协议提供了一种针对混合物，连续和分类研究因素进行配方优化的方法，可最大限度地减少实验设计构建中的主观选择。在分析阶段，采用有效且易于使用的建模拟合程序。

使用设计的混合工艺实验和自验证集成模型 （SVEM） 优化脂质纳米颗粒 （LNP） 配方的工作流程

We present a Quality by Design (QbD) styled approach for optimizing lipid nanoparticle (LNP) formulations, aiming to offer scientists an accessible ...

本文为科学家提供了一个工作流程，用于构建实验设计表并分析各种混合物和工艺因素的实验结果，而无需繁琐且可能不稳定的统计决策。生成的模型可以在多个响应上联合优化，并用于生成信息图形，以汇总联合响应面和单个响应的预测。这些图形比基础统计模型中的参数估计值更易于解释，并且有助于表示产生最理想响应的因子设置。脂质和纳米颗粒配方科学家经常需要为不同的有效载荷或在改变脂质或工艺设置时构建新的配方。我们提供稳健的配方优化方法，最大限度地减少设计结构中出错的可能性，并避免在分析过程中需要广泛的统计和知识。在带日期戳的文档中总结实验的目的。列出将在实验期间测量的响应。选择将在研究期间变化的因子和保持不变的因子。建立不同因子的范围以及每个因子的相关小数精度。使用最小和最大启发式方法确定研究设计规模。打开跳转并导航到菜单栏到 DOI、特殊用途、空间填充设计。输入研究响应。输入研究因子和范围。输入设计的预定运行次数。为所选因子和运行大小生成空间填充设计表。向表中添加注释列，用于注释任何手动创建的运行。如果适用，请手动将基准控制运行合并到系列零件设计表中。包括其中一个受控基准的复制。在注释列中标记基准名称，并对基准复制行进行颜色编码，以便于正确识别。将因子水平的混合舍入到适当的粒度。复制舍入值并将其粘贴到原始列中。删除圆角列的冗余副本。对脂质因子进行舍入后，验证其总和等于 100%如果任何行总和不等于 1，请手动调整其中一个混合因子，确保其保持在因子范围内。完成调整后删除总和列。按照用于对混合因子舍入的相同过程，将过程因子舍入到其各自的粒度。格式化脂质列，使其显示为具有所需小数位数的百分比。如果添加了基准等手动运行，请重新随机化表行顺序，添加具有舍入值的新列。通过右键单击其列标题，按升序对此列进行排序，然后删除该列。生成三元图以可视化脂质因子的设计点。还要检查过程因子的运行分布。配方科学家应确认所有运行的可行性。如果存在不可行的运行，请考虑新发现的约束，重新启动设计。按系列零件设计表提供的顺序运行试验。将读数记录在实验表中内置的列中。绘制读数并检查响应的分布。检查颜色编码仿行（如果包括一个）之间的相对距离，这样可以了解基准处的总过程和分析变异，与由于整个因子空间中因子设置的变化而导致的变异性相比。在三元图上制作运行。根据响应为点着色，以获得混合因子行为的模型独立视图。右键单击任何生成的图形，选择“行图例”，然后选择响应列。对每个响应重复此操作。为每个响应构建一个独立的模型作为研究因子的函数。删除由空间填充设计创建的模型脚本。选择分析，拟合模型。构建包含所有候选效应的完整模型。该模型应包括每个因子的主效应、双向和三向相互作用、过程因子中的二次和偏立方项以及混合因子的舍夫立方项。选择所有研究因子。将度数条目从默认值 2 更改为 3。然后选择阶乘到度数。仅选择非混合因子，然后选择宏、部分立方。仅选择混合因子，然后选择宏、舍夫立方体。禁用默认的无拦截选项。指定响应列，将个性更改为广义回归。将此模型设置保存到数据表中，以便于调用。选择保存到数据表。单击运行。对于估计方法，请选择 SVEM 前向选择。展开高级控制强制项菜单，然后取消选中与混音主效果对应的框。只有拦截术语将保持选中状态。单击 Go.按来自 SVEM 模型的预测响应绘制实际响应，以验证合理的可预测性。单击“SVEM 正向选择”旁边的红色三角形，然后选择“保存列”、“保存预测公式”。这将创建一个新列，其中包含数据表中的预测公式 对每个响应重复模型构建步骤。在所有响应都将预测列保存到数据表后，使用探查器函数绘制所有预测响应列的响应跟踪。选择“图形探查器”，然后选择在上一步中为 Y 预测公式创建的所有预测列，单击“确定”。确定候选的最佳配方。为每个响应设置合意性函数，是应最大化、最小化还是与目标匹配。这还需要为每个响应设置相对重要性权重。要生成第一个候选项，请将任何主要响应设置为使用重要性权重 1.0，并将任何辅助响应设置为使用重要性权重 0.2。指示探查器查找最大化合意函数的最佳因子设置。选择优化合意性，最大化合意性。记录最佳因子设置以及有关每个响应使用的重要性权重的说明。对于可电离脂质类型等分类因子，请找到每个因子水平的条件最佳配方。首先，在探查器中设置每个因子的所需水平。然后按住控制键并在该因子的图形内单击鼠标左键并选择锁定因子设置。这种选择优化和合意性，最大化合意性，以找到条件最优，并将该因子锁定在其当前设置中。完成后，在继续之前解锁因子设置。在修改响应的重要性权重后重复优化过程，可能只优化主要响应或将某些次要响应设置为具有或多或少的重要性权重，从而将其目标设置为无。记录新的最佳候选项。生成因子空间最佳区域的图形摘要。创建一个包含 50， 000 行的数据表，这些行填充了允许因子空间内随机生成的因子设置，以及来自每个响应的简化模型中的相应预测值，以及联合合意性函数。选择输出随机表。将要模拟的运行次数的值更改为 50， 000，然后单击确定。在新创建的表中，添加一个新列，用于计算合意性列的百分位数。在三元图中使用此百分位数列，而不是原始合意性列。右键单击合意性列标题，然后选择新建公式列、分布、累积概率。生成以下图形。反复更改图形的配色方案，以显示每个响应和累积概率列的预测。构建四种脂质因子的三元图。在表中，导航到图形三元图。选择 X 图解的混合因子，然后单击确定。右键单击其中一个生成的图形，选择行图例，然后选择预测响应列。将颜色下拉列表更改为 Jet。这将显示相对于脂质因子表现最佳和最差的区域。当前图显示了当考虑将重要续集的效力最大化为 1 时，以及使用重要续集将 0.2 的大小最小化时，联合合意性的百分位数。在对三元图轴上未显示的任何因子求平均值时。反复更改图形的配色方案，以显示每个响应的预测。同样，根据非混合过程因子（单数或联合）绘制代表独特配方的 50， 000 个颜色编码点，并查找响应和因子之间的关系。查找在最高合意性中产生点产量的因子设置。该图显示了三种离子化脂质类型中每种可以形成的所有制剂的联合合意性。最理想的配方使用H102，H101提供了一些潜在的竞争替代品。探索可能导致不同响应的不同因素组合。将预测探查器及其记住的设置保存回数据表。准备一个表格，列出之前确定的最佳候选项。将基准控制包含在将制定和测量的候选游程集中。如果发现实验中的任何配方产生了理想的结果，也许是优于基准，请选择最好的配方添加到候选表中，并与新配方一起重新测试。右键单击分析器中记住的设置表，然后选择“制作成数据表”。执行确认运行，构建配方并收集读数。比较候选最佳配方的性能。该工作流程已用于许多应用程序。在大多数情况下，我们观察到，与一次使用一个因子优化设置的基准配方相比，效力至少提高了四到五倍。当二级反应共同针对时，改进尤其明显。还可以使用模拟来显示此过程产生的最佳候选者的预期质量。使用本文中描述的示例实验的已知数据生成函数，我们可以将从该工作流程中使用的空间填充设计和基于SVEM的分析中获得的候选最佳配方的质量与传统混合物分析技术获得的质量进行比较。垂直轴上显示了最优公式的质量，水平轴上显示了设计中的运行次数，蓝点表示 150 次模拟中未简化的完整统计模型的性能。琥珀色点表示基于 AICC 目标函数的传统单发前向选择的性能。绿点表示此工作流中使用的基于 SVEM 的前向选择方法的性能。SWEM分析使我们能够获得更好的最佳候选和更少的运行。偶尔会有额外的复杂性研究，需要统计学家的帮助进行设计和分析。对于优先级极高的研究，其中运行规模比平时更有限，或者存在大量分类因子，或者具有大量水平的单个分类因子，统计学家可能会以不同的方式处理。使用最佳或混合设计代替工作流程中指定的空间填充设计。

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Workflow for Lipid Nanoparticle (LNP) Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models (SVEM)

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

隔离和脂质A的化学表征革兰氏阴性菌

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

科研

化学

Conducting Miller-Urey Experiments

在进行米勒 - 尤列实验

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

优化合成蛋白质：Interpositional依赖性的鉴定指示在结构和/或功能性连接的残留

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

使用纳米脂质载体癌症治疗剂，达卡巴嗪封装

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

核磁共振作为鱼油补充剂的血脂的快速评价一个强大的工具

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

在纳米富勒的飞秒衍射实验的长程电子关联的测量

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

用于跟踪纳米粒子自组装的液体细胞透射电子显微镜

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Synthesis of Platinum-nickel Nanowires and Optimization for Oxygen Reduction Performance

铂镍纳米线的合成及减氧性能优化

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Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

原位金纳米粒子合成快速 Nanoprobe 信号增强

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

透射电镜 hFOB 1.19 和 Saos-2 细胞产生的能量色散 X 射线显微分析

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

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