Name: a workflow for lipid nanoparticle (lnp) formulation optimization using designed mixture-process experiments and self-validated ensemble models (svem)
Uploaded: 2023-08-18T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM at JoVE.com

Vi er taknemmelige over for redaktøren og de anonyme dommere for forslag, der forbedrede artiklen.

Forsøget, der er beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater, blev udført i overensstemmelse med vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr, og procedurerne blev udført efter retningslinjer fastlagt af vores Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 6-8 uger gamle Balb/C-hunmus blev anskaffet kommercielt. Dyrene modtog ad libitum standard chow og vand og blev opstaldet under standardbetingelser med 12 timers lys / mørke cyklusser ved en temperatur på 65-75 ° F (~ 18-23 ° C) med 40-6...

<ol>
	<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+lipids+to+power+next+generation+of+mRNA+vaccines.">Better lipids to power next generation of mRNA vaccines.</a> Science. 376 (6594), 680-681 (2022).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+mRNA+nanomedicine.">The landscape of mRNA nanomedicine.</a> Nature Medicine. 28, 2273-2287 (2022).</li><li>Rampado, R., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+experiments+in+the+optimization+of+nanoparticle-based+drug+delivery+systems.">Design of experiments in the optimization of nanoparticle-based drug delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 358, 398-419 (2023).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15, 7300-7306 (2015).</li><li>Jones, B., Nachtsheim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+three-level+designs+for+definitive+screening+in+the+presence+of+second-order+effects.">A class of three-level designs for definitive screening in the presence of second-order effects.</a> Journal of Quality Technology. 43, 1-15 (2011).</li><li>Cornell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments with Mixtures: Designs, Models, and the Analysis of Mixture Data. Wiley Series in Probability and Statistics. , (2002).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+and+improper+use+of+definitive+screening+designs+(DSDs).">Proper and improper use of definitive screening designs (DSDs).</a> JMP user Community. , (2016).</li><li>Myers, R., Montgomery, D., Anderson-Cook, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Response Surface Methodology. , (2016).</li><li>Lekivetz, R., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+flexible+space-filling+designs+for+nonrectangular+regions.">Fast flexible space-filling designs for nonrectangular regions.</a> Quality and Reliability Engineering International. 31, 829-837 (2015).</li><li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-factor-at-a-time+versus+designed+experiments.">One-factor-at-a-time versus designed experiments.</a> The American Statistician. 53, 126-131 (1999).</li><li>Karl, A., Wisnowski, J., Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JMP+Pro+17+remedies+for+practical+struggles+with+mixture+experiments.">JMP Pro 17 remedies for practical struggles with mixture experiments.</a> JMP Discovery Conference. , (2022).</li><li>Lemkus, T., Gotwalt, C., Ramsey, P., Weese, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments.">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 219, 104439 (2021).</li><li>Gotwalt, C., Ramsey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+validation+strategies+for+designed+experiments+using+bootstrapping+techniques+with+applications+to+biopharmaceuticals.">Model validation strategies for designed experiments using bootstrapping techniques with applications to biopharmaceuticals.</a> JMP Discovery Conference. , (2018).</li><li>Xu, L., Gotwalt, C., Hong, Y., King, C. B., Meeker, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+fractional-random-weight+bootstrap.">Applications of the fractional-random-weight bootstrap.</a> The American Statistician. 74 (4), 345-358 (2020).</li><li>Ramsey, P., Levin, W., Lemkus, T., Gotwalt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SVEM:+A+paradigm+shift+in+design+and+analysis+of+experiments.">SVEM: A paradigm shift in design and analysis of experiments.</a> JMP Discovery Conference Europe. , (2021).</li><li>Ramsey, P., Gaudard, M., Levin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+innovation+with+space+filling+mixture+designs,+neural+networks+and+SVEM.">Accelerating innovation with space filling mixture designs, neural networks and SVEM.</a> JMP Discovery Conference. , (2021).</li><li>Lemkus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Validated+Ensemble+modelling.">Self-Validated Ensemble modelling.</a> Doctoral Dissertations. 2707. , (2022).</li><li>Juran, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Juran on Quality by Design: The New Steps for Planning Quality into Goods and Services. , (1992).</li><li>Yu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pharmaceutical+quality+by+design.">Understanding pharmaceutical quality by design.</a> The AAPS Journal. 16, 771 (2014).</li><li>Simpson, J. R., Listak, C. M., Hutto, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+planning+and+evidence+for+assessing+a+well-designed+experiment.">Guidelines for planning and evidence for assessing a well-designed experiment.</a> Quality Engineering. 25, 333-355 (2013).</li><li>Daniel, S., Kis, Z., Kontoravdi, C., Shah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+by+design+for+enabling+RNA+platform+production+processes.">Quality by design for enabling RNA platform production processes.</a> Trends in Biotechnology. 40 (10), 1213-1228 (2022).</li><li>Scheff&#233;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+mixtures.">Experiments with mixtures.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B. 20, 344-360 (1958).</li><li>Brown, L., Donev, A. N., Bissett, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+blending+models+for+data+from+mixture+experiments.">General blending models for data from mixture experiments.</a> Technometrics. 57, 449-456 (2015).</li><li>Herrera, M., Kim, J., Eygeris, Y., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+endosomal+escape+of+polymorphic+lipid+nanoparticles+that+boost+mRNA+delivery.">Illuminating endosomal escape of polymorphic lipid nanoparticles that boost mRNA delivery.</a> Biomaterials Science. 9 (12), 4289-4300 (2021).</li><li>Lemkus, T., Ramsey, P., Gotwalt, C., Weese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments.">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> ArXiv. , 2103.09303 (2021).</li><li>Goos, P., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimal Design of Experiments: A Case Study Approach. , (2011).</li><li>Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOE+Gumbo:+How+hybrid+and+augmenting+designs+can+lead+to+more+effective+design+choices.">DOE Gumbo: How hybrid and augmenting designs can lead to more effective design choices.</a> JMP Discovery Conference. , (2020).</li></ol>

Moderne software til design og analyse af blandingsproceseksperimenter gør det muligt for forskere at forbedre deres lipidnanopartikelformuleringer i en struktureret arbejdsgang, der undgår ineffektive OFAT-eksperimenter. Den nyligt udviklede SVEM-modelleringsmetode eliminerer mange af de mystiske regressionsmodifikationer og modelreduktionsstrategier, der tidligere kan have distraheret forskere med fremmede statistiske overvejelser. Når resultaterne er indsamlet, tilbyder SVEM-analyserammen en tilgang, der både er l...

Lipidnanopartikel (LNP) formuleringer til in vivo genleveringssystemer involverer generelt fire bestanddele lipider fra kategorierne ioniserbare, hjælper og PEG lipider 1,2,3. Uanset om disse lipider undersøges alene eller samtidig med andre ikke-blandingsfaktorer, kræver eksperimenter for disse formuleringer "blandingsdesign", fordi - givet en kandidatformulering - forøgelse eller formindskelse af forholdet mellem et hvilket som helst af lipiderne nødvendigvis fører til et tilsvarende fald eller stigning i summen af forholdet mellem de andre tre lipider.
Til illustration antages det, at vi optimerer en LNP-formulering, der i øjeblikket bruger en fast opskrift, der vil blive behandlet som benchmark. Målet er at maksimere styrken af LNP, mens sekundært sigter mod at minimere den gennemsnitlige partikelstørrelse. De undersøgelsesfaktorer, der varieres i eksperimentet, er molære forhold mellem de fire bestanddele lipider (ioniserbart, kolesterol, DOPE, PEG), N: P-forholdet, strømningshastigheden og den ioniserbare lipidtype. De ioniserbare og hjælpelipider (inklusive kolesterol) får lov til at variere over et bredere udvalg af molært forhold, 10-60%, end PEG, som vil blive varieret fra 1-5% i denne illustration. Benchmarkformuleringsopskriften og intervallerne for de øvrige faktorer og deres afrundingsgranularitet er specificeret i supplerende fil 1. I dette eksempel er forskerne i stand til at udføre 23 kørsler (unikke partier af partikler) på en enkelt dag og vil gerne bruge det som deres prøvestørrelse, hvis den opfylder minimumskravene. Simulerede resultater for dette eksperiment findes i supplerende fil 2 og supplerende fil 3.
Rampado og Peer4 har offentliggjort et nyligt gennemgangspapir om emnet designede eksperimenter til optimering af nanopartikelbaserede lægemiddelleveringssystemer. Kauffman et al.5 overvejede LNP-optimeringsundersøgelser ved hjælp af fraktioneret faktorisk og definitivt screeningsdesign6; Disse typer design kan imidlertid ikke rumme en blandingsbegrænsning uden at ty til ineffektive "slack-variabler"7 og anvendes typisk ikke, når blandingsfaktorer er til stede 7,8. I stedet anvendes "optimale design", der er i stand til at inkorporere en blandingsbegrænsning, traditionelt til blandingsprocesforsøg9. Disse designs er rettet mod en brugerspecificeret funktion af undersøgelsesfaktorerne og er kun optimale (i en af en række mulige sanser), hvis denne funktion fanger det sande forhold mellem undersøgelsesfaktorerne og svarene. Bemærk, at der i teksten skelnes mellem "optimale formuleringer" og "optimale formuleringskandidater", hvor sidstnævnte henviser til de bedste formuleringer, der er identificeret ved hjælp af en statistisk model. Optimale designs har tre hovedulemper ved blandingsprocesforsøg. For det første, hvis forskeren ikke forudser en interaktion mellem undersøgelsesfaktorerne, når han specificerer målmodellen, vil den resulterende model være forudindtaget og kan producere ringere kandidatformuleringer. For det andet placerer optimale designs de fleste kørsler på den ydre grænse af faktorrummet. I LNP-undersøgelser kan dette føre til et stort antal tabte kørsler, hvis partiklerne ikke dannes korrekt ved nogen ekstremer af lipid- eller procesindstillingerne. For det tredje foretrækker forskere ofte at have eksperimentelle kørsler på det indre af faktorrummet for at få en modeluafhængig fornemmelse af responsoverfladen og observere processen direkte i tidligere uudforskede områder af faktorrummet.
Et alternativt designprincip er at sigte mod en omtrentlig ensartet dækning af det (blandingsbegrænsede) faktorrum med et rumfyldende design10. Disse designs ofrer en vis eksperimentel effektivitet i forhold til optimale designs9 (forudsat at hele faktorrummet fører til gyldige formuleringer), men præsenterer flere fordele i en afvejning, der er nyttige i denne applikation. Det rumfyldende design gør ingen a priori antagelser om responsfladens struktur; Dette giver det fleksibilitet til at fange uventede forhold mellem undersøgelsesfaktorerne. Dette strømliner også designgenereringen, fordi det ikke kræver, at der træffes beslutninger om, hvilke regressionsbetingelser der skal tilføjes eller fjernes, når den ønskede kørselsstørrelse justeres. Når nogle designpunkter (opskrifter) fører til mislykkede formuleringer, gør rumudfyldningsdesign det muligt at modellere fejlgrænsen over undersøgelsesfaktorerne, samtidig med at de understøtter statistiske modeller for undersøgelsessvarene over de vellykkede faktorkombinationer. Endelig giver den indvendige dækning af faktorrummet mulighed for modeluafhængig grafisk udforskning af responsoverfladen.
For at visualisere blandingsfaktorunderrummet i et blandingsproceseksperiment anvendes specialiserede trekantede "ternære plots". Figur 1 motiverer denne brug: I terningen af punkter, hvor tre ingredienser hver får lov til at variere fra 0 til 1, fremhæves de punkter, der opfylder en begrænsning om, at summen af ingredienserne er lig med 1, med rødt. Blandingsbegrænsningen på de tre ingredienser reducerer det mulige faktorrum til en trekant. I LNP-applikationer med fire blandingsingredienser producerer vi seks forskellige ternære plots for at repræsentere faktorrummet ved at plotte to lipider ad gangen mod en "Andre" -akse, der repræsenterer summen af de andre lipider.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65200/65200fig01.jpg"> Figur 1: Trekantede faktorregioner. I plottet, der fylder rummet i kuben, repræsenterer de små grå prikker formuleringer, der ikke er i overensstemmelse med blandingsbegrænsningen. De større røde punkter ligger på en trekant indskrevet i terningen og repræsenterer formuleringer, for hvilke blandingsbegrænsningen er opfyldt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65200/65200fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Ud over lipidblandingsfaktorerne er der ofte en eller flere kontinuerlige procesfaktorer såsom N: P-forhold, bufferkoncentration eller strømningshastighed. Kategoriske faktorer kan være til stede, såsom ioniserbar lipidtype, hjælperlipidtype eller buffertype. Målet er at finde en formulering (en blanding af lipider og indstillinger for procesfaktorer), der maksimerer en vis grad af styrke og / eller forbedrer fysiokemiske egenskaber såsom minimering af partikelstørrelse og PDI (polydispersitetsindeks), maksimering af procentindkapsling og minimering af bivirkninger - såsom vægttab - i in vivo-undersøgelser . Selv når man starter fra en rimelig benchmarkopskrift, kan der være interesse for at optimere igen givet en ændring i den genetiske nyttelast eller når man overvejer ændringer i procesfaktorerne eller lipidtyperne.
Cornell7 giver en endelig tekst om de statistiske aspekter af blandings- og blandingsproceseksperimenter, hvor Myers et al.9 giver et fremragende resumé af de mest relevante blandingsdesign- og analyseemner til optimering. Disse værker kan dog overbelaste forskere med statistiske detaljer og med specialiseret terminologi. Moderne software til design og analyse af eksperimenter giver en robust løsning, der i tilstrækkelig grad understøtter de fleste LNP-optimeringsproblemer uden at skulle appellere til den relevante teori. Mens mere komplicerede eller højt prioriterede undersøgelser stadig vil drage fordel af samarbejde med en statistiker og kan anvende optimale snarere end pladsudfyldende design, er vores mål at forbedre forskernes komfortniveau og tilskynde til optimering af LNP-formuleringer uden at appellere til ineffektiv OFAT-test (en-faktor ad gangen)11 eller blot nøjes med den første formulering, der opfylder specifikationerne.
I denne artikel præsenteres en arbejdsgang, der bruger statistisk software til at optimere et generisk LNP-formuleringsproblem, der adresserer design- og analyseproblemer i den rækkefølge, de vil blive stødt på. Faktisk vil metoden fungere for generelle optimeringsproblemer og er ikke begrænset til LNP'er. Undervejs behandles flere almindelige spørgsmål, der opstår, og der gives anbefalinger, der er baseret på erfaring og simuleringsresultater12. Den nyligt udviklede ramme for selvvaliderede ensemblemodeller (SVEM)13 har i høj grad forbedret den ellers skrøbelige tilgang til analyse af resultater fra blandingsproceseksperimenter, og vi bruger denne tilgang til at give en forenklet strategi for formuleringsoptimering. Mens arbejdsgangen er konstrueret på en generel måde, der kunne følges ved hjælp af andre softwarepakker, er JMP 17 Pro unik ved at tilbyde SVEM sammen med de grafiske resuméværktøjer, som vi har fundet nødvendige for at forenkle den ellers mystiske analyse af blandingsproceseksperimenter. Som følge heraf findes JMP-specifikke instruktioner også i protokollen.
SVEM anvender det samme lineære regressionsmodelgrundlag som den traditionelle tilgang, men det giver os mulighed for at undgå kedelige ændringer, der er nødvendige for at passe til en "fuld model" af kandidateffekter ved at bruge enten en fremadrettet udvælgelse eller en straffet selektionsbasistilgang (Lasso). Derudover giver SVEM en forbedret "reduceret model" tilpasning, der minimerer potentialet for at inkorporere støj (proces plus analytisk varians), der vises i dataene. Det fungerer ved at beregne gennemsnittet af de forudsagte modeller, der fremkommer ved gentagne gange at omvægte den relative betydning af hver kørsel i modellen 13,14,15,16,17,18. SVEM giver en ramme for modellering af blandingsproceseksperimenter, der både er lettere at implementere end traditionel single-shot regression og giver bedre kvalitet optimale formuleringskandidater12,13. De matematiske detaljer i SVEM ligger uden for rammerne af dette papir, og selv et overfladisk resumé ud over den relevante litteraturgennemgang ville distrahere fra dets største fordel i denne applikation: det giver mulighed for en enkel, robust og nøjagtig klik-til-kør-procedure for praktikere.
Den præsenterede arbejdsgang er i overensstemmelse med Quality by Design (QbD)19-tilgangen til farmaceutisk udvikling20. Resultatet af undersøgelsen vil være en forståelse af det funktionelle forhold, der forbinder materialeattributterne og procesparametrene med kritiske kvalitetsattributter (CQA'er)21. Daniel et al.22 diskuterer brugen af en QbD-ramme specifikt til RNA-platformproduktion: vores arbejdsgang kan bruges som et værktøj inden for denne ramme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>JMP Pro 17.1</td>
			<td>JMP Statistical Discovery LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a workflow for lipid nanoparticle (lnp) formulation optimization using designed mixture-process experiments and self-validated ensemble models (svem)

Vi præsenterer en Quality by Design (QbD) stil tilgang til optimering af lipid nanopartikel (LNP) formuleringer, der sigter mod at tilbyde forskere en tilgængelig arbejdsgang. Den iboende begrænsning i disse undersøgelser, hvor molære forhold mellem ioniserbare, hjælper og PEG-lipider skal tilføje op til 100%, kræver specialiserede design- og analysemetoder for at imødekomme denne blandingsbegrænsning. Med fokus på lipid- og procesfaktorer, der almindeligvis anvendes i LNP-designoptimering, giver vi trin, der undgår mange af de vanskeligheder, der traditionelt opstår i design og analyse af blandingsproceseksperimenter ved at anvende rumpåfyldningsdesign og udnytte den nyligt udviklede statistiske ramme for selvvaliderede ensemblemodeller (SVEM). Ud over at producere kandidatoptimale formuleringer bygger workflowet også grafiske resuméer af de tilpassede statistiske modeller, der forenkler fortolkningen af resultaterne. De nyligt identificerede kandidatformuleringer vurderes med bekræftelseskørsler og kan eventuelt udføres i forbindelse med et mere omfattende andetfasestudie.

Denne tilgang er blevet valideret på tværs af begge bredt klassificerede lipidtyper: MC3-lignende klassiske lipider og lipidoider (f.eks. C12-200), generelt afledt af kombinatorisk kemi. Sammenlignet med en benchmark LNP-formulering udviklet ved hjælp af en One Factor at a Time (OFAT) -metode viser kandidatformuleringerne, der genereres gennem vores arbejdsgang, ofte styrkeforbedringer på 4 til 5 gange på en logaritmisk skala, som vist i museleverluciferaseaflæsningerne i figur 18. <st...

Watch this Scientific Journal Video about A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM at JoVE.com

A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM

Denne protokol giver en tilgang til formuleringsoptimering over blandings-, kontinuerlige og kategoriske undersøgelsesfaktorer, der minimerer subjektive valg i den eksperimentelle designkonstruktion. Til analysefasen anvendes en effektiv og brugervenlig modelleringstilpasningsprocedure.

En arbejdsgang for lipidnanopartikelformuleringsoptimering (LNP) ved hjælp af designede blandingsproceseksperimenter og selvvaliderede ensemblemodeller (SVEM)

We present a Quality by Design (QbD) styled approach for optimizing lipid nanoparticle (LNP) formulations, aiming to offer scientists an accessible ...

Denne artikel indeholder en arbejdsgang for forskere til at konstruere en eksperimentel designtabel og analysere eksperimentelle resultater over en række blandings- og procesfaktorer uden at kræve kedelige og potentielt flygtige statistiske beslutninger. De resulterende modeller kan optimeres i fællesskab over flere svar og bruges til at producere informativ grafik til at opsummere både den fælles responsoverflade og forudsigelserne af de enkelte svar. Disse grafikker er lettere at fortolke end parameterestimaterne fra de underliggende statistiske modeller og er nyttige til at repræsentere de faktorindstillinger, der giver de mest ønskelige svar.Lipid- og nanopartikelformuleringsforskere har ofte brug for at konstruere nye opskrifter til forskellige nyttelast, eller når de ændrer lipider eller procesindstillinger. Vi leverer en robust tilgang til formuleringsoptimering, der minimerer risikoen for fejl i designkonstruktion, og undgår behovet for omfattende statistik og viden under analysen. Opsummer formålet med eksperimentet i et datostemplet dokument.Angiv de svar, der måles under eksperimentet. Vælg de faktorer, der vil blive varieret, og dem, der vil blive holdt konstante under undersøgelsen. Fastlæg intervallerne for de forskellige faktorer og den relevante decimalpræcision for hver.Bestem undersøgelsens designstørrelse ved hjælp af minimum og maksimum heuristik. Åbn spring og naviger menulinjen til DOI, Special Purpose, Space Filling Design. Angiv undersøgelsessvarene.Indtast undersøgelsesfaktorerne og intervallerne. Indtast det forudbestemte antal kørsler for designet. Generer designtabellen til pladsfyldning for de valgte faktorer og kørselsstørrelse.Føj en notekolonne til tabellen for at anmærke manuelt oprettede kørsler. Hvis det er relevant, skal du manuelt inkorporere benchmarkkontrolkørsler i designtabellen. Medtag en replikat for et af de kontrollerede benchmarks.Markér benchmarknavnet i notekolonnen, og farvekode, benchmarket replikerer rækkerne for nem korrekt identifikation. Blandingen af faktorniveauer afrundes til den passende granularitet. Kopiér de afrundede værdier, og indsæt dem i de oprindelige kolonner.Slet overflødige kopier af de afrundede kolonner. Efter afrunding af lipidfaktorerne skal du kontrollere, at deres sum er lig med 100%Hvis en rækkesum ikke er lig med en, skal du manuelt justere en af blandingsfaktorerne og sikre, at den forbliver inden for faktorområdet. Slet sumkolonnen, når justeringerne er udført.Følg den samme procedure, der anvendes til afrunding af blandingsfaktorerne for at afrunde procesfaktorerne til deres respektive granularitet. Formater lipidkolonnerne, så de vises som procenter med et ønsket antal decimaler. Hvis du har tilføjet manuelle kørsler, f.eks. benchmarks, skal du randomisere tabellens rækkefølge igen, tilføje en ny kolonne med afrundede værdier.Sorter denne kolonne i stigende rækkefølge ved at højreklikke på kolonneoverskriften, og slet derefter kolonnen. Generer ternære plots for at visualisere designpunkterne over lipidfaktorerne. Undersøg også kørselsfordelingen over procesfaktorerne.Formuleringsforskerne skal bekræfte gennemførligheden af alle kørsler. Hvis der findes umulige kørsler, skal du genstarte designet i betragtning af de nyligt opdagede begrænsninger. Kør eksperimentet i den rækkefølge, der er angivet i designtabellen.Registrer udlæsningerne i den kolonne, der er indbygget i eksperimenttabellen. Plot aflæsningerne og undersøg fordelingen af svarene. Undersøg den relative afstand mellem de farvekodede replikationskørsler, hvis en var inkluderet, dette giver mulighed for forståelse af den samlede proces og analytiske variation ved benchmarket sammenlignet med variabiliteten på grund af ændringerne i faktorindstillingerne på tværs af hele faktorrummet.Lav kørslerne på en ternær grund. Farv punkterne i henhold til svarene for at få et modeluafhængigt billede af adfærden over blandingsfaktorerne. Højreklik på en af de resulterende grafer, vælg Rækkeforklaring, og vælg derefter svarkolonnen.Gentag dette for hvert svar. Byg en uafhængig model for hvert svar som en funktion af undersøgelsesfaktorerne. Slet de modelscripts, der blev oprettet af pladsudfyldningsdesignet.Vælg Analyser, tilpas model. Konstruer en komplet model, der omfatter alle kandidateffekter. Denne model skal omfatte hovedvirkningerne af hver faktor, to- og trevejsinteraktioner, kvadratiske og delvise kubiske termer i procesfaktorerne og Scheffe-kubiktermer for blandingsfaktorerne.Vælg alle undersøgelsesfaktorerne. Skift posten for grad til tre fra standard to. Vælg derefter en Factorial to Degree.Vælg kun faktorerne uden blanding, og vælg derefter Makroer, Delvis kubisk. Vælg kun blandingsfaktorerne, og vælg derefter Makroer, Scheffe Cubic. Deaktiver standardindstillingen uden skæringspunkt.Angiv svarkolonnen, skift personlighed til generaliseret regression. Gem denne modelopsætning i datatabellen for nem tilbagekaldelse. Vælg Gem i datatabel.Klik på Kør. Som estimeringsmetode skal du vælge SVEM Forward Selection. Udvid menuerne Avancerede kontroller Kraftudtryk, og fjern markeringen i afkrydsningsfelterne, der svarer til blandingens hovedeffekter.Kun perioden Skæringspunkt forbliver markeret. Klik på Go.Plot de faktiske svar ud fra deres forudsagte svar fra SVEM-modellen for at bekræfte en rimelig forudsigelighed. Klik på den røde trekant ud for SVEM Forward Selection, og vælg Gem kolonner, Gem forudsigelsesformel.Dette opretter en ny kolonne, der indeholder forudsigelsesformlen i datatabellen Gentag trinnene til modelopbygning for hvert svar. Når alle svarene har gemt forudsigelseskolonner i datatabellen, skal du afbilde svarsporingerne for alle de forudsagte svarkolonner ved hjælp af en profilfunktion. Vælg Grafprofil, og vælg alle de forudsigelseskolonner, der blev oprettet i forrige trin, for Y-forudsigelsesformel skal du klikke på OK.Identificer kandidatoptimale formuleringer. Indstil ønskelighedsfunktionen for hvert svar, om det skal maksimeres, minimeres eller matches til et mål. Dette indebærer også, at der fastsættes vægte for relativ vigtighed for hvert svar.Hvis du vil generere den første kandidat, skal du angive alle primære svar til at bruge vigtighedsvægt 1,0 og eventuelle sekundære svar til at bruge vigtighedsvægt 0,2. Instruer profilen i at finde de optimale faktorindstillinger, der maksimerer ønskefunktionen. Vælg Optimering ønskværdighed, Maksimer ønskværdighed.Registrer de optimale faktorindstillinger sammen med en note om de vigtighedsvægtninger, der bruges til hvert svar. For kategoriske faktorer såsom ioniserbar lipidtype skal du finde de betinget optimale formuleringer for hvert faktorniveau. Indstil først det ønskede niveau for hver faktor i profilen.Hold derefter kontroltasten nede, og venstreklik inde i grafen for den faktor, og vælg Låsfaktorindstilling. Denne valgte optimering og ønskværdighed maksimerer ønskeligheden for at finde det betingede optimale med denne faktor låst i sin nuværende indstilling. Når du er færdig, skal du låse faktorindstillingerne op, før du fortsætter.Gentag optimeringsprocessen efter at have ændret svarets vigtighedsvægte, måske kun optimere de primære svar eller indstille nogle af de sekundære svar til at have mere eller mindre vigtighedsvægt, hvorved deres mål sættes til ingen. Optag den nye optimale kandidat. Fremstil grafiske oversigter over de optimale områder af faktorrummet.Opret en datatabel, der indeholder 50.000 rækker, der er befolket med tilfældigt genererede faktorindstillinger inden for det tilladte faktorrum sammen med de tilsvarende forudsagte værdier fra de reducerede modeller for hvert af svarene samt den fælles ønskelighedsfunktion. Vælg output tilfældig tabel. Skift værdien af hvor mange kørsler der skal simuleres til 50.000 og klik på Okay.I den nyoprettede tabel skal du tilføje en ny kolonne, der beregner fraktilen af kolonnen ønskværdighed. Brug denne fraktilkolonne i de ternære afbildninger i stedet for den rå ønskværdighedskolonne. Højreklik på kolonneoverskriften Ønskelighed, og vælg Ny formelkolonne, Fordeling, Kumulativ sandsynlighed.Generer følgende grafik. Ændre grafikkens farveskema gentagne gange for at få vist forudsigelserne for hvert svar og for kolonnen med akkumuleret sandsynlighed. Konstruere ternære plots for de fire lipidfaktorer.I tabellen skal du navigere til graf ternær plot. Vælg blandingsfaktorerne for X-afbildning, og klik på OK. Højreklik i en af de resulterende grafer, vælg Rækkeforklaring, og vælg derefter kolonnen med forudsagt svar.Skift farverne ned til Jet. Dette vil vise de bedste og dårligste regioner med hensyn til lipidfaktorerne. Den aktuelle figur viser percentilerne af ledønskværdigheden, når man overvejer at maksimere styrken med vigtig efterfølger til 1 og minimere størrelsen med vigtig efterfølger til 0.2.Mens gennemsnittet over alle faktorer, der ikke vises på den ternære plotakse. Skift grafikkens farveskema gentagne gange for at få vist forudsigelserne for hvert svar. På samme måde plottes de 50.000 farvekodede punkter, der repræsenterer unikke formuleringer mod ikke-blandingsprocesfaktorerne, enten ental eller i fællesskab, og se efter forhold mellem svarene og faktorerne.Se efter de faktorindstillinger, der producerer pointudbyttet i den højeste ønskelighed. Denne figur viser den fælles ønskværdighed af alle de formuleringer, der kunne dannes med hver af de tre ioniserede lipidtyper. De mest ønskelige formuleringer bruger H102, hvor H101 giver nogle potentielt konkurrencedygtige alternativer.Udforsk forskellige kombinationer af faktorer, der kan føre til forskellige svar. Gem forudsigelsesprofilen og dens huskede indstillinger i datatabellen igen. Forbered en tabel med de optimale kandidater, der tidligere er identificeret.Medtag benchmarkkontrolelementet med det sæt kandidatkørsler, der skal formuleres og måles. Hvis nogen af formuleringerne fra eksperimentet viste sig at give ønskelige resultater, måske ved at overgå benchmarket, skal du vælge det bedste, der skal føjes til kandidattabellen og teste igen sammen med nye formuleringer. Højreklik på den huskede indstillingstabel i profilen, og vælg Gør til datatabel.Udfør bekræftelseskørslerne, konstruer formuleringerne og saml aflæsningerne. Sammenlign ydeevnen af kandidatens optimale formuleringer. Arbejdsprocessen er blevet brugt i mange applikationer.I de fleste tilfælde har vi observeret mindst fire til fem gange forbedring i styrke, når vi sammenligner med benchmarkformuleringer, der er indstillet ved hjælp af en faktor ad gangen. Forbedringer er især mærkbare, når sekundære svar målrettes i fællesskab. Det er også muligt at bruge simulering til at vise den forventede kvalitet af de optimale kandidater, der produceres ved denne procedure.Ved hjælp af en kendt datagenererende funktion til eksempeleksperimentet beskrevet i papiret kan vi sammenligne kvaliteten af kandidatens optimale formuleringer opnået fra rumfyldningsdesign og SVEM-baseret analyse, der anvendes i denne arbejdsgang, med dem, der opnås fra de traditionelle blandingsanalyseteknikker. Med kvaliteten af optimal formulering vist på den lodrette akse og antallet af kørsler i designet vist på den vandrette akse, repræsenterer de blå punkter ydeevnen for den ureducerede fulde statistiske model over 150 simuleringer. De gule punkter repræsenterer udførelsen af det traditionelle valg af enkeltskud fremad baseret på AICC-objektivfunktionen.De grønne punkter repræsenterer resultaterne af den SVEM-baserede tilgang til fremadrettet udvælgelse, der bruges i denne arbejdsgang. SVEM-analysen giver os mulighed for at opnå bedre optimale kandidater og færre kørsler. Der vil være lejlighedsvise undersøgelser med yderligere kompleksitet, der kræver hjælp fra en statistiker til design og analyse.Undersøgelser, der er ekstremt højt prioriterede, hvor kørselsstørrelsen er mere begrænset end normalt, eller der er et stort antal kategoriske faktorer, eller en enkelt kategorisk faktor med et stort antal niveauer kan gribes forskelligt an af en statistiker. Brug af enten optimale eller hybride designs i stedet for det pladsudfyldningsdesign, der er angivet i arbejdsgangen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Workflow for Lipid Nanoparticle (LNP) Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models (SVEM)

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering og kemisk karakterisering af lipid A fra gramnegative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Conducting Miller-Urey Experiments

Gennemføre Miller-Urey Eksperimenter

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimering af syntetiske Proteiner: Identifikation af Interpositional Afhængigheder Angivelse Strukturelt og / eller funktionelt knyttet Rester

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

Indkapsling af Cancer Therapeutic Agent Dacarbazin Brug af nanostrukturerede Lipid Carrier

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR spektroskopi som et robust værktøj til Rapid Evaluering af Lipid Profil af fiskeolie kosttilskud

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Målinger af langtrækkende elektroniske korrelationer under femtosekund diffraktion eksperimenter udført på nanokrystaller af Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Væske-celle transmissions elektronmikroskopi til sporing samlesæt af nanopartikler

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Synthesis of Platinum-nickel Nanowires and Optimization for Oxygen Reduction Performance

Syntese af Platinum-nikkel Nanowires og optimering for ilt reduktion ydeevne

Platinum-nickel (Pt-Ni) nanowires were developed as fuel cell electrocatalysts, and were optimized for the performance and durability in the oxygen ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Hurtig Nanoprobe Signal forstærkning af In Situ guld nanopartikel syntese

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Analyse af mineraler produceret af hFOB 1,19 og Saos-2 celler ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi med Energy Dispersive X-ray mikroanalyser

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...