Name: a workflow for lipid nanoparticle (lnp) formulation optimization using designed mixture-process experiments and self-validated ensemble models (svem)
Uploaded: 2023-08-18T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM at JoVE.com

אנו מודים לעורך ולשופטים האנונימיים על הצעות ששיפרו את המאמר.

הניסוי המתואר בסעיף התוצאות המייצגות בוצע בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והנהלים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). נקבות עכברי Balb/C בנות 6-8 שבועות הושגו באופן מסחרי. בעלי החיים קיבלו צ'או ומים סטנדרטיים ושוכנו בתנאים סטנדרטיים עם ?...

<ol>
	<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+lipids+to+power+next+generation+of+mRNA+vaccines.">Better lipids to power next generation of mRNA vaccines.</a> Science. 376 (6594), 680-681 (2022).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+mRNA+nanomedicine.">The landscape of mRNA nanomedicine.</a> Nature Medicine. 28, 2273-2287 (2022).</li><li>Rampado, R., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+experiments+in+the+optimization+of+nanoparticle-based+drug+delivery+systems.">Design of experiments in the optimization of nanoparticle-based drug delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 358, 398-419 (2023).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15, 7300-7306 (2015).</li><li>Jones, B., Nachtsheim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+three-level+designs+for+definitive+screening+in+the+presence+of+second-order+effects.">A class of three-level designs for definitive screening in the presence of second-order effects.</a> Journal of Quality Technology. 43, 1-15 (2011).</li><li>Cornell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments with Mixtures: Designs, Models, and the Analysis of Mixture Data. Wiley Series in Probability and Statistics. , (2002).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+and+improper+use+of+definitive+screening+designs+(DSDs).">Proper and improper use of definitive screening designs (DSDs).</a> JMP user Community. , (2016).</li><li>Myers, R., Montgomery, D., Anderson-Cook, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Response Surface Methodology. , (2016).</li><li>Lekivetz, R., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+flexible+space-filling+designs+for+nonrectangular+regions.">Fast flexible space-filling designs for nonrectangular regions.</a> Quality and Reliability Engineering International. 31, 829-837 (2015).</li><li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-factor-at-a-time+versus+designed+experiments.">One-factor-at-a-time versus designed experiments.</a> The American Statistician. 53, 126-131 (1999).</li><li>Karl, A., Wisnowski, J., Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JMP+Pro+17+remedies+for+practical+struggles+with+mixture+experiments.">JMP Pro 17 remedies for practical struggles with mixture experiments.</a> JMP Discovery Conference. , (2022).</li><li>Lemkus, T., Gotwalt, C., Ramsey, P., Weese, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments.">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 219, 104439 (2021).</li><li>Gotwalt, C., Ramsey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+validation+strategies+for+designed+experiments+using+bootstrapping+techniques+with+applications+to+biopharmaceuticals.">Model validation strategies for designed experiments using bootstrapping techniques with applications to biopharmaceuticals.</a> JMP Discovery Conference. , (2018).</li><li>Xu, L., Gotwalt, C., Hong, Y., King, C. B., Meeker, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+fractional-random-weight+bootstrap.">Applications of the fractional-random-weight bootstrap.</a> The American Statistician. 74 (4), 345-358 (2020).</li><li>Ramsey, P., Levin, W., Lemkus, T., Gotwalt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SVEM:+A+paradigm+shift+in+design+and+analysis+of+experiments.">SVEM: A paradigm shift in design and analysis of experiments.</a> JMP Discovery Conference Europe. , (2021).</li><li>Ramsey, P., Gaudard, M., Levin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+innovation+with+space+filling+mixture+designs,+neural+networks+and+SVEM.">Accelerating innovation with space filling mixture designs, neural networks and SVEM.</a> JMP Discovery Conference. , (2021).</li><li>Lemkus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Validated+Ensemble+modelling.">Self-Validated Ensemble modelling.</a> Doctoral Dissertations. 2707. , (2022).</li><li>Juran, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Juran on Quality by Design: The New Steps for Planning Quality into Goods and Services. , (1992).</li><li>Yu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pharmaceutical+quality+by+design.">Understanding pharmaceutical quality by design.</a> The AAPS Journal. 16, 771 (2014).</li><li>Simpson, J. R., Listak, C. M., Hutto, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+planning+and+evidence+for+assessing+a+well-designed+experiment.">Guidelines for planning and evidence for assessing a well-designed experiment.</a> Quality Engineering. 25, 333-355 (2013).</li><li>Daniel, S., Kis, Z., Kontoravdi, C., Shah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+by+design+for+enabling+RNA+platform+production+processes.">Quality by design for enabling RNA platform production processes.</a> Trends in Biotechnology. 40 (10), 1213-1228 (2022).</li><li>Scheff&#233;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+mixtures.">Experiments with mixtures.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B. 20, 344-360 (1958).</li><li>Brown, L., Donev, A. N., Bissett, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+blending+models+for+data+from+mixture+experiments.">General blending models for data from mixture experiments.</a> Technometrics. 57, 449-456 (2015).</li><li>Herrera, M., Kim, J., Eygeris, Y., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+endosomal+escape+of+polymorphic+lipid+nanoparticles+that+boost+mRNA+delivery.">Illuminating endosomal escape of polymorphic lipid nanoparticles that boost mRNA delivery.</a> Biomaterials Science. 9 (12), 4289-4300 (2021).</li><li>Lemkus, T., Ramsey, P., Gotwalt, C., Weese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments.">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> ArXiv. , 2103.09303 (2021).</li><li>Goos, P., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimal Design of Experiments: A Case Study Approach. , (2011).</li><li>Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOE+Gumbo:+How+hybrid+and+augmenting+designs+can+lead+to+more+effective+design+choices.">DOE Gumbo: How hybrid and augmenting designs can lead to more effective design choices.</a> JMP Discovery Conference. , (2020).</li></ol>

תוכנה מודרנית לתכנון וניתוח של ניסויי תהליך תערובות מאפשרת למדענים לשפר את נוסחאות ננו-חלקיקי השומנים שלהם בתהליך עבודה מובנה המונע ניסויי OFAT לא יעילים. גישת מידול SVEM שפותחה לאחרונה מבטלת רבים משינויי הרגרסיה הארכאיים ואסטרטגיות הפחתת המודלים שאולי הסיחו בעבר את דעתם של מדענים עם שיקול?...

ניסוחים של ננו-חלקיקי ליפידים (LNP) עבור מערכות העברת גנים in vivo כוללות בדרך כלל ארבעה ליפידים מרכיבים מהקטגוריות של ליפידים מיוננים, עוזרים ו-PEG 1,2,3. בין אם ליפידים אלה נחקרים לבד או בו זמנית עם גורמים אחרים שאינם תערובת, ניסויים עבור ניסוחים אלה דורשים עיצובי "תערובת" מכיוון - בהינתן ניסוח מועמד - הגדלת או הקטנת היחס בין כל אחד מהליפידים מובילה בהכרח לירידה או עלייה מקבילה בסכום היחסים של שלושת הליפידים האחרים.
לשם המחשה, ההנחה היא שאנחנו מייעלים ניסוח LNP שכרגע משתמש במתכון מוגדר שיטופל כאמת המידה. המטרה היא למקסם את העוצמה של LNP תוך שאיפה משנית למזער את גודל החלקיקים הממוצע. גורמי המחקר המגוונים בניסוי הם היחסים המולריים של ארבעת השומנים המרכיבים (מיוננים, כולסטרול, DOPE, PEG), יחס N:P, קצב הזרימה וסוג השומנים המיוננים. השומנים המיוננים והמסייעים (כולל כולסטרול) מורשים להשתנות בטווח רחב יותר של יחס מולארי, 10-60%, מאשר PEG, אשר ישתנה בין 1-5% באיור זה. מתכון ניסוח אמת המידה והטווחים של הגורמים האחרים וגרעיניות העיגול שלהם מפורטים בקובץ משלים 1. לדוגמה זו, המדענים מסוגלים לבצע 23 ריצות (קבוצות ייחודיות של חלקיקים) ביום אחד ורוצים להשתמש בו כגודל הדגימה שלהם אם הוא עומד בדרישות המינימום. תוצאות סימולציה של ניסוי זה מופיעות בקובץ משלים 2 ובקובץ משלים 3.
Rampado ו-Peer4 פרסמו לאחרונה מאמר סקירה בנושא ניסויים מתוכננים לאופטימיזציה של מערכות אספקת תרופות מבוססות ננו-חלקיקים. Kauffman et al.5 שקלו מחקרי אופטימיזציה של LNP באמצעות עיצובי סינון חלקיים וסופיים6; עם זאת, סוגים אלה של עיצובים אינם יכולים להתאים לאילוץ תערובת מבלי להזדקק לשימוש ב"משתני רפיון" לא יעילים7 ואינם משמשים בדרך כלל כאשר גורמי תערובת קיימים 7,8. במקום זאת, "עיצובים אופטימליים" המסוגלים לשלב אילוץ תערובת משמשים באופן מסורתי לניסויים בתהליך תערובות9. עיצובים אלה מכוונים לפונקציה שצוינה על-ידי המשתמש של גורמי המחקר והם אופטימליים (באחד ממספר מובנים אפשריים) רק אם פונקציה זו לוכדת את הקשר האמיתי בין גורמי המחקר ותגובותיהם. יש לשים לב כי קיימת הבחנה בטקסט בין "עיצובים אופטימליים" לבין "מועמדים לניסוח אופטימלי", כאשר האחרון מתייחס לניסוחים הטובים ביותר המזוהים על ידי מודל סטטיסטי. עיצובים אופטימליים מגיעים עם שלושה חסרונות עיקריים לניסויים בתהליך תערובת. ראשית, אם המדען אינו מצליח לצפות אינטראקציה של גורמי המחקר בעת ציון מודל היעד, אז המודל המתקבל יהיה מוטה ויכול לייצר ניסוחים מועמדים נחותים. שנית, עיצובים אופטימליים מציבים את רוב הריצות על הגבול החיצוני של חלל הפקטור. במחקרי LNP, זה יכול להוביל למספר רב של ריצות אבודות אם החלקיקים אינם נוצרים כראוי בכל הקצוות של הגדרות השומנים או התהליך. שלישית, מדענים מעדיפים לעתים קרובות לערוך ריצות ניסוי על פנים מרחב הגורמים כדי לקבל תחושה בלתי תלויה במודל של משטח התגובה ולצפות בתהליך ישירות באזורים שלא נחקרו בעבר במרחב הגורמים.
עיקרון תכנון חלופי הוא לכוון לכיסוי אחיד משוער של מרחב הגורם (מוגבל התערובת) עם עיצוב ממלא חלל10. עיצובים אלה מקריבים יעילות ניסויית מסוימת ביחס לעיצובים אופטימליים9 (בהנחה שכל מרחב הגורמים מוביל לניסוחים תקפים) אך מציגים מספר יתרונות בפשרה שהם שימושיים ביישום זה. תכנון מילוי החלל אינו מניח הנחות אפריוריות לגבי מבנה משטח התגובה; זה נותן לו את הגמישות ללכוד יחסים בלתי צפויים בין גורמי המחקר. זה גם מייעל את יצירת העיצוב מכיוון שהוא אינו דורש קבלת החלטות לגבי אילו מונחי רגרסיה להוסיף או להסיר כאשר גודל הריצה הרצוי מותאם. כאשר נקודות עיצוב מסוימות (מתכונים) מובילות לניסוחים כושלים, עיצובים ממלאים מקום מאפשרים למדל את גבול הכשל מעל גורמי המחקר תוך תמיכה במודלים סטטיסטיים לתגובות המחקר על פני שילובי הגורמים המוצלחים. לבסוף, הכיסוי הפנימי של מרחב הגורמים מאפשר חקירה גרפית בלתי תלויה במודל של משטח התגובה.
כדי לדמיין את תת-המרחב של גורם התערובת של ניסוי תערובת-תהליך, נעשה שימוש ב"חלקות טרינריות" משולשות מיוחדות. איור 1 מניע את השימוש הזה: בקובייה של נקודות שבהן מאפשרים לכל אחד שלושה מרכיבים לנוע בין 0 ל-1, הנקודות שמקיימות אילוץ שסכום המרכיבים שווה ל-1 מסומנות באדום. אילוץ התערובת על שלושת המרכיבים מקטין את שטח הגורם האפשרי למשולש. ביישומי LNP עם ארבעה מרכיבי תערובת, אנו מייצרים שש חלקות טרינריות שונות המייצגות את מרחב הגורמים על ידי התוויית שני ליפידים בכל פעם כנגד ציר "אחרים" המייצג את סכום הליפידים האחרים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65200/65200fig01.jpg"> איור 1: אזורי גורם משולש. בחלקת מילוי החלל בתוך הקובייה, הנקודות האפורות הקטנות מייצגות ניסוחים שאינם עולים בקנה אחד עם אילוץ התערובת. הנקודות האדומות הגדולות יותר מונחות על משולש החקוק בתוך הקובייה ומייצגות ניסוחים שעבורם אילוץ התערובת מסופק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65200/65200fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בנוסף לגורמי תערובת השומנים, לעתים קרובות ישנם גורם תהליך רציף אחד או יותר כגון יחס N:P, ריכוז חיץ או קצב זרימה. גורמים קטגוריים עשויים להיות נוכחים, כגון סוג שומנים מיוננים, סוג שומנים עוזר או סוג חיץ. המטרה היא למצוא נוסחה (תערובת של שומנים והגדרות לגורמי תהליך) שממקסמת מידה מסוימת של עוצמה ו/או משפרת מאפיינים פיזיוכימיים כגון מזעור גודל החלקיקים וה-PDI (מדד פיזור רב), מקסום אחוזי הקפסולה, וממזערת תופעות לוואי - כגון ירידה במשקל הגוף - במחקרי in vivo . גם כאשר מתחילים ממתכון בנצ'מרק סביר, ייתכן שיהיה עניין באופטימיזציה מחדש בהינתן שינוי במטען הגנטי או כאשר שוקלים שינויים בגורמי התהליך או בסוגי השומנים.
קורנל7 מספק טקסט סופי על ההיבטים הסטטיסטיים של ניסויי תערובות ותערובת-תהליך, כאשר מאיירס ואחרים 9 מספקים סיכום מצוין של נושאי תכנון וניתוח התערובת הרלוונטיים ביותר לאופטימיזציה. עם זאת, עבודות אלה יכולות להעמיס על מדענים פרטים סטטיסטיים ועם טרמינולוגיה מיוחדת. תוכנה מודרנית לתכנון וניתוח ניסויים מספקת פתרון חזק שיתמוך מספיק ברוב בעיות האופטימיזציה של LNP מבלי לפנות לתיאוריה הרלוונטית. בעוד שמחקרים מסובכים יותר או בעלי עדיפות גבוהה עדיין יפיקו תועלת משיתוף פעולה עם סטטיסטיקאי ועשויים להשתמש בעיצובים אופטימליים ולא ממלאים מקום, מטרתנו היא לשפר את רמת הנוחות של מדענים ולעודד אופטימיזציה של פורמולציות LNP מבלי לפנות לבדיקות לא יעילות של גורם אחד בכל פעם (OFAT)11 או פשוט להסתפק בנוסחה הראשונה העונה על המפרטים.
במאמר זה, מוצגת זרימת עבודה המשתמשת בתוכנה סטטיסטית כדי לייעל בעיית ניסוח LNP גנרית, ומטפלת בבעיות תכנון וניתוח לפי הסדר שבו הן ייתקלו בהן. למעשה, השיטה תעבוד עבור בעיות אופטימיזציה כלליות ואינה מוגבלת ל- LNPs. לאורך הדרך מטופלות מספר שאלות נפוצות שעולות וניתנות המלצות המעוגנות בניסיון ובתוצאות סימולציה12. המסגרת שפותחה לאחרונה של מודלים של אנסמבל מאומת עצמית (SVEM)13 שיפרה מאוד את הגישה השברירית לניתוח תוצאות מניסויים בתהליך תערובת, ואנו משתמשים בגישה זו כדי לספק אסטרטגיה פשוטה יותר לאופטימיזציה של פורמולציה. בעוד זרימת העבודה בנויה באופן כללי שניתן לעקוב אחריו באמצעות חבילות תוכנה אחרות, JMP 17 Pro ייחודי בכך שהוא מציע SVEM יחד עם כלי הסיכום הגרפיים שמצאנו כנחוצים כדי לפשט את הניתוח הארכאי של ניסויים בתהליך תערובת. כתוצאה מכך, הוראות ספציפיות JMP מסופקות גם בפרוטוקול.
SVEM משתמש באותו בסיס מודל רגרסיה ליניארית כמו הגישה המסורתית, אך הוא מאפשר לנו להימנע משינויים מייגעים הנדרשים כדי להתאים ל"מודל מלא" של השפעות מועמדים באמצעות בחירת קדימה או גישת בסיס בחירה נענשת (לאסו). בנוסף, SVEM מספק התאמת "מודל מופחת" משופרת הממזערת את הפוטנציאל לשילוב רעש (תהליך בתוספת שונות אנליטית) המופיע בנתונים. זה עובד על ידי ממוצע המודלים החזויים הנובעים משקלול חוזר ונשנה של החשיבות היחסית של כל ריצה במודל 13,14,15,16,17,18. SVEM מספק מסגרת למידול ניסויים בתהליך תערובת, שהיא גם קלה יותר ליישום מאשר רגרסיה מסורתית של ירייה בודדת וגם מניבה מועמדים לניסוח אופטימלי באיכות טובה יותר12,13. הפרטים המתמטיים של SVEM הם מעבר להיקף של מאמר זה ואפילו סיכום שטחי מעבר לסקירת הספרות הרלוונטית יסיח את הדעת מהיתרון העיקרי שלו ביישום זה: הוא מאפשר הליך פשוט, חזק ומדויק של לחץ והפעל עבור מתרגלים.
זרימת העבודה המוצגת עולה בקנה אחד עם גישת איכות לפי עיצוב (QbD)19 לפיתוח תרופות20. תוצאת המחקר תהיה הבנה של הקשר הפונקציונלי המקשר בין תכונות החומר ופרמטרי התהליך לתכונות איכות קריטיות (CQAs)21. דניאל ואחרים 22 דנים בשימוש במסגרת QbD במיוחד לייצור פלטפורמת RNA: זרימת העבודה שלנו יכולה לשמש ככלי במסגרת זו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>JMP Pro 17.1</td>
			<td>JMP Statistical Discovery LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a workflow for lipid nanoparticle (lnp) formulation optimization using designed mixture-process experiments and self-validated ensemble models (svem)

אנו מציגים גישה בסגנון איכות לפי עיצוב (QbD) לאופטימיזציה של נוסחאות ננו-חלקיקי שומנים (LNP), במטרה להציע למדענים זרימת עבודה נגישה. המגבלה המובנית במחקרים אלה, שבהם היחסים המולריים של שומנים מיוננים, מסייעים ו-PEG חייבים להצטבר עד 100%, דורשת שיטות תכנון וניתוח מיוחדות כדי להתאים לאילוץ תערובת זה. תוך התמקדות בגורמי שומנים ותהליכים המשמשים בדרך כלל באופטימיזציה של תכנון LNP, אנו מספקים צעדים המונעים רבים מהקשיים המתעוררים באופן מסורתי בתכנון וניתוח של ניסויי תהליך תערובות על ידי שימוש בעיצובים ממלאים חלל וניצול המסגרת הסטטיסטית שפותחה לאחרונה של מודלי אנסמבל מאומתים עצמיים (SVEM). בנוסף להפקת ניסוחים אופטימליים למועמדים, זרימת העבודה בונה גם סיכומים גרפיים של המודלים הסטטיסטיים המותאמים המפשטים את פרשנות התוצאות. ניסוחי המועמדים החדשים שזוהו מוערכים באמצעות ריצות אישור ולחלופין ניתן לבצע אותם בהקשר של מחקר מקיף יותר בשלב השני.

גישה זו אומתה בשני סוגי השומנים המסווגים באופן רחב: ליפידים קלאסיים דמויי MC3 וליפידואידים (למשל, C12-200), הנגזרים בדרך כלל מכימיה קומבינטורית. בהשוואה לנוסחת LNP שפותחה בשיטת One Factor at a Time (OFAT), הניסוחים המועמדים שנוצרו באמצעות זרימת העבודה שלנו הדגימו לעתים קרובות שיפורי עוצמה של פי 4 עד פי 5 בסול...

Watch this Scientific Journal Video about A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM at JoVE.com

A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM

פרוטוקול זה מספק גישה לאופטימיזציה של ניסוח על פני גורמי מחקר מתערובת, רציפים וקטגוריים הממזערת בחירות סובייקטיביות במבנה התכנון הניסויי. בשלב הניתוח נעשה שימוש בהליך התאמת מידול יעיל וקל לשימוש.

תהליך עבודה לאופטימיזציה של נוסחת ננו-חלקיקי שומנים (LNP) באמצעות ניסויים מתוכננים בתהליך תערובות ומודלים של אנסמבל מאומת עצמי (SVEM)

We present a Quality by Design (QbD) styled approach for optimizing lipid nanoparticle (LNP) formulations, aiming to offer scientists an accessible ...

מאמר זה מספק זרימת עבודה למדענים לבניית טבלת תכנון ניסוי ולניתוח תוצאות ניסוי על פני מגוון גורמי תערובת ותהליך, מבלי לדרוש החלטות סטטיסטיות מייגעות ותנודתיות. המודלים המתקבלים יכולים להיות ממוטבים במשותף על פני תגובות מרובות ולהשתמש בהם כדי לייצר גרפיקה אינפורמטיבית כדי לסכם הן את משטח התגובה המשותף והן את התחזיות של התגובות הבודדות. קל יותר לפרש גרפיקות אלה מאשר אומדני הפרמטרים מהמודלים הסטטיסטיים הבסיסיים, והן מועילות בייצוג הגדרות הגורמים המייצרות את התגובות הרצויות ביותר.מדעני ניסוח שומנים וננו-חלקיקים נדרשים לעתים קרובות לבנות מתכונים חדשים עבור מטענים שונים או בעת שינוי שומנים או הגדרות תהליך. אנו מספקים גישה חזקה לאופטימיזציה של פורמולציות הממזערת את הפוטנציאל לטעויות בבניית תכנון, ומונעת את הצורך בידע סטטיסטי וידע נרחב במהלך הניתוח. סכם את מטרת הניסוי במסמך עם חותמת תאריך.רשום את התגובות שיימדדו במהלך הניסוי. בחר את הגורמים שיהיו מגוונים ואלה שיוחזקו קבועים במהלך המחקר. קבע את הטווחים עבור הגורמים השונים ואת הדיוק העשרוני הרלוונטי עבור כל אחד מהם.החלט על גודל עיצוב המחקר באמצעות היוריסטיקות מינימליות ומקסימליות. קפיצה פתוחה ונווט בשורת התפריטים אל DOI, Special Purpose, Space Filling Design. הזן את תגובות המחקר.הזן את גורמי המחקר ואת הטווחים. הזן את מספר הריצות שנקבע מראש עבור העיצוב. צור את טבלת העיצוב למילוי החלל עבור הגורמים שנבחרו וגודל ההפעלה.הוסף עמודת הערות לטבלה כדי להוסיף ביאורים להפעלות שנוצרו באופן ידני. אם ישים, שלב באופן ידני פקדי ביצועים בטבלת העיצוב. כלול עותק משוכפל עבור אחד מאמות המידה המבוקרות.סמן את שם אמת המידה בעמודה הערות וקוד צבע אמת המידה משכפלת שורות לצורך זיהוי נכון קל. עיגלו את תערובת רמות הגורמים לרמת הפירוט המתאימה. העתק את הערכים המעוגלים והדבק אותם בעמודות המקוריות.מחק את העותקים המיותרים של העמודות המעוגלות. לאחר עיגול גורמי השומנים, ודא שהסכום שלהם שווה ל- 100%אם סכום שורות כלשהו אינו שווה לסכום אחד, התאם ידנית את אחד מגורמי התערובת, וודא שהוא נשאר בטווח הגורמים. מחק את עמודת הסכום לאחר ביצוע ההתאמות.בצע את אותו הליך המשמש לעיגול גורמי התערובת כדי לעגל את גורמי התהליך לרמת הפירוט המתאימה שלהם. עצב את עמודות השומנים כך שיופיעו כאחוזים עם מספר עשרוני רצוי. אם הוספת הפעלות ידניות כגון אמות מידה, בצע אקראיות של סדר השורות בטבלה, הוסף עמודה חדשה עם ערכים מעוגלים.מיין עמודה זו בסדר עולה על-ידי לחיצה ימנית על כותרת העמודה שלה ולאחר מכן מחק את העמודה. צור חלקות טרינריות כדי להמחיש את נקודות העיצוב מעל גורמי השומנים. כמו כן, לבחון את התפלגות הריצה על גורמי התהליך.מדעני הניסוח צריכים לאשר היתכנות של כל הריצות. אם קיימות ריצות בלתי ישימות, הפעל מחדש את העיצוב בהתחשב באילוצים החדשים שהתגלו. הפעל את הניסוי בסדר שסופק על-ידי טבלת העיצוב.הקלט את הקריאות בעמודה המוכללת בטבלת הניסויים. שרטט את הקריאות ובחן את התפלגות התגובות. בחן את המרחק היחסי בין ריצות השכפול המקודדות בצבע אם נכלל אחד, דבר המאפשר הבנה של התהליך הכולל והשונות האנליטית בבנצ'מרק, בהשוואה לשונות עקב השינויים בהגדרות הגורמים על פני כל מרחב הגורמים.לעצב את הריצות על חלקות טרינריות. צבעו את הנקודות בהתאם לתגובות כדי לקבל תצוגה עצמאית של ההתנהגות על פני גורמי התערובת. לחץ לחיצה ימנית על כל אחד מהגרפים המתקבלים, בחר מקרא שורה ולאחר מכן בחר את עמודת התגובה.חזור על פעולה זו עבור כל תגובה. בניית מודל עצמאי לכל תגובה כפונקציה של גורמי המחקר. מחק את סקריפטי המודל שנוצרו על-ידי עיצוב מילוי החלל.בחר נתח, התאם מודל. בניית מודל מלא הכולל את כל השפעות המועמדים. מודל זה צריך לכלול את ההשפעות העיקריות של כל גורם, אינטראקציות דו-כיווניות ותלת-כיווניות, מונחים מעוקבים ריבועיים וחלקיים חלקיים בגורמי התהליך ומונחים מעוקבים של Scheffe עבור גורמי התערובת.בחר את כל גורמי המחקר. שנה את הערך עבור תואר לשלוש מברירת המחדל של שתיים. לאחר מכן בחר Factorial to Degree.בחר רק את הגורמים שאינם תערובת ולאחר מכן בחר פקודות מאקרו, קוביות חלקיות. בחר רק את גורמי התערובת ולאחר מכן בחר פקודות מאקרו, Scheffe Cubic. הפוך את אפשרות ברירת המחדל ללא יירוט ללא זמינה.ציין את עמודת התגובה, שנה את האישיות לרגרסיה כללית. שמור מודל זה מוגדר בטבלת הנתונים לאחזור קל. בחר שמור בטבלת הנתונים.לחץ על הפעל. לשיטת הערכה, בחר SVEM Forward Selection. הרחב את התפריטים Advanced Controls Force Terms ובטל את סימון התיבות המתאימות לאפקטים העיקריים של התערובת.רק תקופת היירוט תישאר מסומנת. לחץ על Go.Pplot את התגובות בפועל לפי התגובות החזויות שלהן ממודל SVEM כדי לאמת יכולת חיזוי סבירה. לחץ על המשולש האדום לצד SVEM Forward Selection ובחר Save Columns, Save Prediction Formula.פעולה זו יוצרת עמודה חדשה המכילה את נוסחת החיזוי בטבלת הנתונים חזור על שלבי בניית המודל עבור כל תגובה. לאחר שלכל התגובות נשמרו עמודות חיזוי בטבלת הנתונים, התווה את עוקבי התגובה עבור כל עמודות התגובה החזויות באמצעות פונקציית פרופיילר. בחר Graph Profiler ובחר את כל עמודות החיזוי שנוצרו בשלב הקודם עבור נוסחת חיזוי Y, לחץ על אישור.זהה ניסוחים אופטימליים למועמדים. הגדר את פונקציית הרצויות עבור כל תגובה אם יש למקסם אותה, למזער אותה או להתאים אותה למטרה. הדבר כרוך גם בקביעת משקלות החשיבות היחסית לכל תגובה.כדי ליצור את המועמד הראשון, הגדר את כל התגובות הראשוניות לשימוש במשקל חשיבות 1.0 ואת כל התגובות המשניות לשימוש במשקל חשיבות 0.2. הנחות את יוצר הפרופילים למצוא את הגדרות הגורם האופטימליות הממקסמות את פונקציית הרצון. בחר Optimization Desirability, Maxim Desirability.רשום את הגדרות הגורמים האופטימליים יחד עם הערה על שקלולי החשיבות המשמשים לכל תגובה. עבור גורמים קטגוריאליים כגון סוג שומנים מיוננים, מצא את הניסוחים האופטימליים המותנים עבור כל רמת גורם. ראשית, הגדר את הרמה הרצויה של כל גורם בפרופילר.לאחר מכן החזק את מקש הבקרה ולחץ לחיצה שמאלית בתוך הגרף של גורם זה ובחר הגדרת גורם נעילה. זה בחר אופטימיזציה ורצון, למקסם את הרצון למצוא את האופטימלי מותנה עם גורם זה נעול ההגדרה הנוכחית שלה. בסיום, בטל את נעילת הגדרות הגורם לפני שתמשיך.חזור על תהליך האופטימיזציה לאחר שינוי משקלי החשיבות של התגובה, אולי רק אופטימיזציה של התגובות הראשוניות או הגדרת חלק מהתגובות המשניות כבעלות משקל חשיבות פחות או יותר, כלומר הגדרת מטרתן לאפס. רשום את המועמד האופטימלי החדש. הפק סיכומים גרפיים של האזורים האופטימליים של מרחב הגורמים.צור טבלת נתונים המכילה 50, 000 שורות המאוכלסות בהגדרות גורמים שנוצרו באופן אקראי בתוך מרחב הגורמים המותר, יחד עם הערכים החזויים המתאימים מהמודלים המופחתים עבור כל אחת מהתגובות, כמו גם פונקציית הרצויות המשותפת. בחר פלט טבלה אקראית. שנה את הערך של מספר הריצות שיש לדמות ל- 50, 000 ולחץ על אישור.בטבלה החדשה שנוצרה, הוסף עמודה חדשה המחשבת את אחוזון עמודת הכדאיות. השתמש בעמודת אחוזון זו בתרשימים הטרינריים במקום בעמודת הרצויות הגולמית. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כותרת העמודה Desirability ובחר New Formula Column, Distributional, Cumulative Probability.צור את הגרפיקה הבאה. שנה שוב ושוב את ערכת הצבעים של הגרפיקה כדי להציג את התחזיות עבור כל תגובה, ועבור עמודת ההסתברות המצטברת. בניית חלקות טרינריות עבור ארבעת גורמי השומנים.בטבלה, נווט לתרשים טרינרי של גרף. בחרו בגורמי התערובת להתוויית X ולחצו על 'אשר'. לחץ לחיצה ימנית באחד הגרפים שנוצרו, בחר מקרא שורה ולאחר מכן בחר את עמודת התגובה החזויה.שנה את התפריט הנפתח של הצבעים ל- Jet. זה יציג את האזורים בעלי הביצועים הטובים והגרועים ביותר ביחס לגורמי השומנים. האיור הנוכחי מראה את אחוזי הרצון של המפרק כאשר שוקלים למקסם את העוצמה עם המשך חשוב ל-1, ולמזער את הגודל עם המשך חשוב ל-0.2.תוך ממוצע על כל הגורמים שאינם מוצגים על ציר העלילה הטרינרית. שנה שוב ושוב את ערכת הצבעים של הגרפיקה כדי להציג את התחזיות עבור כל תגובה. באופן דומה, התווה את 50,000 הנקודות המקודדות בצבע המייצגות ניסוחים ייחודיים כנגד גורמי התהליך שאינם תערובת יחיד או משותף, וחפש קשרים בין התגובות לבין הגורמים.חפש את הגדרות הגורם המייצרות את התשואה בנקודות ברצון הגבוה ביותר. איור זה מראה את הכדאיות המשותפת של כל הפורמולציות שניתן ליצור עם כל אחד משלושת סוגי השומנים המיוננים. הפורמולציות הרצויות ביותר משתמשות ב-H102, כאשר H101 מספק כמה חלופות תחרותיות פוטנציאליות.חקור שילובים שונים של גורמים שעשויים להוביל לתגובות שונות. שמור את פרופיל החיזוי ואת ההגדרות הזכורות שלו בחזרה בטבלת הנתונים. הכינו טבלה המפרטת את המועמדים האופטימליים שזוהו בעבר.כלול את בקרת אמת המידה עם קבוצת ריצות המועמדים שתגובש ותמדוד. אם אחד מהניסוחים מהניסוי נמצא כמניב תוצאות רצויות, אולי על ידי ביצועים טובים יותר מאמת המידה, בחר את הטוב ביותר להוסיף לטבלת המועמדים ובדוק שוב יחד עם ניסוחים חדשים. לחץ לחיצה ימנית על טבלת ההגדרות הנזכרות בפרופיל ובחר הפוך לטבלת נתונים.בצע את ריצות האישור, בנה את הניסוחים ואסוף את הקריאות. השווה את הביצועים של ניסוחים אופטימליים של המועמד. זרימת העבודה שימשה ביישומים רבים.ברוב המקרים, ראינו שיפור של לפחות פי ארבעה עד חמישה בעוצמה כאשר אנו משווים לנוסחאות ביצועים שנקבעו באמצעות גורם אחד בכל פעם אופטימיזציה. שיפורים בולטים במיוחד כאשר תגובות משניות ממוקדות במשותף. ניתן גם להשתמש בסימולציה כדי להראות את האיכות הצפויה של המועמדים האופטימליים המיוצרים על ידי הליך זה.באמצעות פונקציית הפקת נתונים ידועה עבור הניסוי לדוגמה המתואר במאמר, אנו יכולים להשוות את איכות הניסוחים האופטימליים של המועמדים שהתקבלו מעיצובי מילוי החלל והניתוח מבוסס SVEM המשמשים בתהליך עבודה זה לאלה שהתקבלו מטכניקות ניתוח התערובות המסורתיות. עם איכות הניסוח האופטימלי המוצג על הציר האנכי ומספר הריצות בעיצוב המוצג על הציר האופקי, הנקודות הכחולות מייצגות את הביצועים של המודל הסטטיסטי המלא שלא צומצם מעל 150 סימולציות. נקודות הענבר מייצגות את הביצועים של הבחירה המסורתית של ירייה בודדת קדימה בהתבסס על הפונקציה האובייקטיבית AICC.הנקודות הירוקות מייצגות את הביצועים של גישת הבחירה קדימה המבוססת על SVEM המשמשת בתהליך עבודה זה. ניתוח SVEM מאפשר לנו להשיג מועמדים אופטימליים טובים יותר ופחות ריצות. מדי פעם יתקיימו מחקרים בעלי מורכבות נוספת הדורשים את עזרתו של סטטיסטיקאי לצורך תכנון וניתוח.מחקרים בעדיפות גבוהה ביותר, שבהם גודל הריצה מוגבל מהרגיל, או שיש מספר רב של גורמים קטגוריאליים, או גורם קטגורי יחיד עם מספר רב של רמות עשויים לגשת אחרת על ידי סטטיסטיקאי. שימוש בעיצובים אופטימליים או היברידיים במקום עיצוב מילוי החלל שצוין בזרימת העבודה.

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Workflow for Lipid Nanoparticle (LNP) Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models (SVEM)

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Conducting Miller-Urey Experiments

ביצוע ניסויי מילר יורי

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

ושאריות או זיהוי של Interpositional תלות המציין מבני / צמודות תפקודית: אופטימיזציה של חלבונים סינטטיים

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

Encapsulation של Dacarbazine הסוכן הטיפולי הסרטן בעזרת Carrier ליפידים Nanostructured

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR ספקטרוסקופיה כמו כלי חזק עבור ההערכה המהירה של פרופיל השומנים של תוספי שמן דגים

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

מדידות של מתאמים אלקטרונית לטווח ארוך במהלך הניסויים עקיפה הפמטו-שנייה מתבצע על Nanocrystals של Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים נוזלי-תא לצורך מעקב הרכבה עצמית של חלקיקים

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Synthesis of Platinum-nickel Nanowires and Optimization for Oxygen Reduction Performance

סינתזה של פלטינה וניקל Nanowires ואופטימיזציה לביצועים הפחתת חמצן

Platinum-nickel (Pt-Ni) nanowires were developed as fuel cell electrocatalysts, and were optimized for the performance and durability in the oxygen ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

שיפור האות Nanoprobe מהירה על ידי באתרו בתוך Nanoparticle זהב סינתזה

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

ניתוח של מינרלים המיוצר על ידי hFOB 1.19 ואלקטרון Saos-2 תאים באמצעות שידור עם אנרגיה ואנליזת רנטגן Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...