Name: a workflow for lipid nanoparticle (lnp) formulation optimization using designed mixture-process experiments and self-validated ensemble models (svem)
Uploaded: 2023-08-18T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM at JoVE.com

Vi takker redaktøren og de anonyme dommerne for forslag som forbedret artikkelen.

Forsøket beskrevet i avsnittet om representative resultater ble utført i samsvar med veiledningen for pleie og bruk av forsøksdyr, og prosedyrene ble utført etter retningslinjer fastsatt av vår institusjonelle dyrepleie- og brukskomité (IACUC). 6-8 uker gamle kvinnelige Balb / C mus ble kommersielt oppnådd. Dyrene fikk ad libitum standard chow og vann og ble plassert under standardforhold med 12 timers lys / mørke sykluser, ved en temperatur på 65-75 ° F (~ 18-23 ° C) med 40-60% fuktighet.
<p clas...

<ol>
	<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+lipids+to+power+next+generation+of+mRNA+vaccines.">Better lipids to power next generation of mRNA vaccines.</a> Science. 376 (6594), 680-681 (2022).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+mRNA+nanomedicine.">The landscape of mRNA nanomedicine.</a> Nature Medicine. 28, 2273-2287 (2022).</li><li>Rampado, R., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+experiments+in+the+optimization+of+nanoparticle-based+drug+delivery+systems.">Design of experiments in the optimization of nanoparticle-based drug delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 358, 398-419 (2023).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15, 7300-7306 (2015).</li><li>Jones, B., Nachtsheim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+three-level+designs+for+definitive+screening+in+the+presence+of+second-order+effects.">A class of three-level designs for definitive screening in the presence of second-order effects.</a> Journal of Quality Technology. 43, 1-15 (2011).</li><li>Cornell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments with Mixtures: Designs, Models, and the Analysis of Mixture Data. Wiley Series in Probability and Statistics. , (2002).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+and+improper+use+of+definitive+screening+designs+(DSDs).">Proper and improper use of definitive screening designs (DSDs).</a> JMP user Community. , (2016).</li><li>Myers, R., Montgomery, D., Anderson-Cook, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Response Surface Methodology. , (2016).</li><li>Lekivetz, R., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+flexible+space-filling+designs+for+nonrectangular+regions.">Fast flexible space-filling designs for nonrectangular regions.</a> Quality and Reliability Engineering International. 31, 829-837 (2015).</li><li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-factor-at-a-time+versus+designed+experiments.">One-factor-at-a-time versus designed experiments.</a> The American Statistician. 53, 126-131 (1999).</li><li>Karl, A., Wisnowski, J., Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JMP+Pro+17+remedies+for+practical+struggles+with+mixture+experiments.">JMP Pro 17 remedies for practical struggles with mixture experiments.</a> JMP Discovery Conference. , (2022).</li><li>Lemkus, T., Gotwalt, C., Ramsey, P., Weese, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments.">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 219, 104439 (2021).</li><li>Gotwalt, C., Ramsey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+validation+strategies+for+designed+experiments+using+bootstrapping+techniques+with+applications+to+biopharmaceuticals.">Model validation strategies for designed experiments using bootstrapping techniques with applications to biopharmaceuticals.</a> JMP Discovery Conference. , (2018).</li><li>Xu, L., Gotwalt, C., Hong, Y., King, C. B., Meeker, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+fractional-random-weight+bootstrap.">Applications of the fractional-random-weight bootstrap.</a> The American Statistician. 74 (4), 345-358 (2020).</li><li>Ramsey, P., Levin, W., Lemkus, T., Gotwalt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SVEM:+A+paradigm+shift+in+design+and+analysis+of+experiments.">SVEM: A paradigm shift in design and analysis of experiments.</a> JMP Discovery Conference Europe. , (2021).</li><li>Ramsey, P., Gaudard, M., Levin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+innovation+with+space+filling+mixture+designs,+neural+networks+and+SVEM.">Accelerating innovation with space filling mixture designs, neural networks and SVEM.</a> JMP Discovery Conference. , (2021).</li><li>Lemkus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Validated+Ensemble+modelling.">Self-Validated Ensemble modelling.</a> Doctoral Dissertations. 2707. , (2022).</li><li>Juran, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Juran on Quality by Design: The New Steps for Planning Quality into Goods and Services. , (1992).</li><li>Yu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pharmaceutical+quality+by+design.">Understanding pharmaceutical quality by design.</a> The AAPS Journal. 16, 771 (2014).</li><li>Simpson, J. R., Listak, C. M., Hutto, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+planning+and+evidence+for+assessing+a+well-designed+experiment.">Guidelines for planning and evidence for assessing a well-designed experiment.</a> Quality Engineering. 25, 333-355 (2013).</li><li>Daniel, S., Kis, Z., Kontoravdi, C., Shah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+by+design+for+enabling+RNA+platform+production+processes.">Quality by design for enabling RNA platform production processes.</a> Trends in Biotechnology. 40 (10), 1213-1228 (2022).</li><li>Scheff&#233;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+mixtures.">Experiments with mixtures.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B. 20, 344-360 (1958).</li><li>Brown, L., Donev, A. N., Bissett, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+blending+models+for+data+from+mixture+experiments.">General blending models for data from mixture experiments.</a> Technometrics. 57, 449-456 (2015).</li><li>Herrera, M., Kim, J., Eygeris, Y., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+endosomal+escape+of+polymorphic+lipid+nanoparticles+that+boost+mRNA+delivery.">Illuminating endosomal escape of polymorphic lipid nanoparticles that boost mRNA delivery.</a> Biomaterials Science. 9 (12), 4289-4300 (2021).</li><li>Lemkus, T., Ramsey, P., Gotwalt, C., Weese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments.">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> ArXiv. , 2103.09303 (2021).</li><li>Goos, P., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimal Design of Experiments: A Case Study Approach. , (2011).</li><li>Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOE+Gumbo:+How+hybrid+and+augmenting+designs+can+lead+to+more+effective+design+choices.">DOE Gumbo: How hybrid and augmenting designs can lead to more effective design choices.</a> JMP Discovery Conference. , (2020).</li></ol>

Moderne programvare for design og analyse av blandingsprosesseksperimenter gjør det mulig for forskere å forbedre lipidnanopartikkelformuleringene i en strukturert arbeidsflyt som unngår ineffektiv OFAT-eksperimentering. Den nylig utviklede SVEM-modelleringstilnærmingen eliminerer mange av de uforståelige regresjonsmodifikasjonene og modellreduksjonsstrategiene som tidligere kan ha distrahert forskere med fremmede statistiske hensyn. Når resultatene er samlet inn, tilbyr SVEM-analyserammeverket en tilnærming som b...

Lipid nanopartikkel (LNP) formuleringer for in vivo genleveringssystemer involverer generelt fire bestanddeler lipider fra kategoriene ioniserbare, hjelper- og PEG-lipider 1,2,3. Hvorvidt disse lipidene blir studert alene eller samtidig med andre ikke-blandingsfaktorer, krever eksperimenter for disse formuleringene "blanding" -design fordi - gitt en kandidatformulering - økning eller reduksjon av forholdet mellom en av lipidene nødvendigvis fører til en tilsvarende reduksjon eller økning i summen av forholdene mellom de tre andre lipidene.
For illustrasjon antas det at vi optimaliserer en LNP-formulering som for tiden bruker en fast oppskrift som vil bli behandlet som referanseindeksen. Målet er å maksimere styrken av LNP mens sekundært sikte på å minimere gjennomsnittlig partikkelstørrelse. Studiefaktorene som er varierte i forsøket er molforholdene mellom de fire bestanddelene lipider (ioniserbar, kolesterol, DOPE, PEG), N: P-forholdet, strømningshastigheten og den ioniserbare lipidtypen. De ioniserbare og hjelperlipidene (inkludert kolesterol) får lov til å variere over et bredere spekter av molforhold, 10-60%, enn PEG, som vil bli variert fra 1-5% i denne illustrasjonen. Referanseformuleringsoppskriften og områdene for de andre faktorene og deres avrundingsgranularitet er spesifisert i tilleggsfil 1. For dette eksempelet kan forskerne utføre 23 løp (unike grupper av partikler) på en enkelt dag og vil gjerne bruke det som prøvestørrelse hvis det oppfyller minimumskravene. Simulerte resultater for dette eksperimentet finnes i tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3.
Rampado og Peer4 har publisert et nylig gjennomgangspapir om temaet designede eksperimenter for optimalisering av nanopartikkelbaserte legemiddelleveringssystemer. Kauffman et al.5 vurderte LNP-optimaliseringsstudier ved bruk av fraksjonelle faktorielle og definitive screeningdesign6; Imidlertid kan disse typer design ikke imøtekomme en blandingsbegrensning uten å ty til bruk av ineffektive "slakkvariabler"7 og brukes vanligvis ikke når blandingsfaktorer er tilstede 7,8. I stedet brukes "optimale design" som er i stand til å inkorporere en blandingsbegrensning, tradisjonelt til blandingsprosesseksperimenter9. Disse designene retter seg mot en brukerspesifisert funksjon av studiefaktorene og er bare optimale (i en av flere mulige sanser) hvis denne funksjonen fanger det sanne forholdet mellom studiefaktorene og responsene. Merk at det er et skille i teksten mellom "optimale design" og "optimale formuleringskandidater", der sistnevnte refererer til de beste formuleringene identifisert av en statistisk modell. Optimale design har tre hovedulemper for blandingsprosesseksperimenter. For det første, hvis forskeren ikke klarer å forutse en interaksjon av studiefaktorene ved spesifisering av målmodellen, vil den resulterende modellen være partisk og kan produsere dårligere kandidatformuleringer. For det andre plasserer optimale design de fleste løpene på den ytre grensen til faktorrommet. I LNP-studier kan dette føre til et stort antall tapte løp hvis partiklene ikke dannes riktig i noen ytterpunkter av lipid- eller prosessinnstillingene. For det tredje foretrekker forskere ofte å ha eksperimentelle løp på det indre av faktorrommet for å få en modelluavhengig følelse av responsflaten og å observere prosessen direkte i tidligere uutforskede regioner av faktorrommet.
Et alternativt designprinsipp er å sikte mot en tilnærmet jevn dekning av (blandingsbegrenset) faktorrom med en plassfyllingsdesign10. Disse designene ofrer noe eksperimentell effektivitet i forhold til optimale design9 (forutsatt at hele faktorrommet fører til gyldige formuleringer), men presenterer flere fordeler i en avveining som er nyttige i denne applikasjonen. Romfyllingsdesignet gjør ingen a priori antagelser om strukturen til responsflaten; Dette gir den fleksibilitet til å fange opp uventede forhold mellom studiefaktorene. Dette strømlinjeformer også designgenereringen fordi det ikke krever å ta beslutninger om hvilke regresjonstermer som skal legges til eller fjernes etter hvert som ønsket kjørestørrelse justeres. Når noen designpunkter (oppskrifter) fører til mislykkede formuleringer, gjør plassfyllingsdesign det mulig å modellere feilgrensen over studiefaktorene, samtidig som de støtter statistiske modeller for studieresponsene over de vellykkede faktorkombinasjonene. Til slutt gir den indre dekningen av faktorrommet mulighet for modelluavhengig grafisk utforskning av responsflaten.
For å visualisere blandingsfaktorens underrom i et blandingsprosesseksperiment, brukes spesialiserte trekantede "ternære tomter". Figur 1 motiverer denne bruken: I kuben av punkter der tre ingredienser hver får lov til å variere fra 0 til 1, er punktene som tilfredsstiller en begrensning om at summen av ingrediensene er lik 1, uthevet i rødt. Blandingsbegrensningen på de tre ingrediensene reduserer det mulige faktorrommet til en trekant. I LNP-applikasjoner med fire blandingsingredienser produserer vi seks forskjellige ternære plott for å representere faktorrommet ved å plotte to lipider om gangen mot en "Andre" -akse som representerer summen av de andre lipidene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65200/65200fig01.jpg"> Figur 1: Trekantede faktorregioner. I romfyllingsplottet i kuben representerer de små grå prikkene formuleringer som ikke stemmer overens med blandingsbegrensningen. De større røde punktene ligger på en trekant innskrevet i kuben og representerer formuleringer som blandingsbegrensningen er tilfredsstilt for. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65200/65200fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
I tillegg til lipidblandingsfaktorene er det ofte en eller flere kontinuerlige prosessfaktorer som N:P-forhold, bufferkonsentrasjon eller strømningshastighet. Kategoriske faktorer kan være til stede, for eksempel ioniserbar lipidtype, hjelperlipidtype eller buffertype. Målet er å finne en formulering (en blanding av lipider og innstillinger for prosessfaktorer) som maksimerer noe mål på potens og / eller forbedrer fysiokjemiske egenskaper som å minimere partikkelstørrelse og PDI (polydispersitetsindeks), maksimere prosentvis innkapsling og minimere bivirkninger - som kroppsvekt tap - i in vivo-studier . Selv når man starter fra en rimelig referanseoppskrift, kan det være interesse for å optimalisere på nytt gitt en endring i den genetiske nyttelasten eller når man vurderer endringer i prosessfaktorene eller lipidtypene.
Cornell7 gir en definitiv tekst om de statistiske aspektene ved blandings- og blandingsprosesseksperimenter, med Myers et al.9 som gir et utmerket sammendrag av de mest relevante blandingsdesign- og analyseemnene for optimalisering. Imidlertid kan disse arbeidene overbelaste forskere med statistiske detaljer og med spesialisert terminologi. Moderne programvare for design og analyse av eksperimenter gir en robust løsning som tilstrekkelig støtter de fleste LNP-optimaliseringsproblemer uten å måtte appellere til den aktuelle teorien. Mens mer kompliserte eller høyt prioriterte studier fortsatt vil ha nytte av samarbeid med en statistiker og kan bruke optimale snarere enn plassfyllende design, er vårt mål å forbedre komfortnivået til forskere og oppmuntre til optimalisering av LNP-formuleringer uten å appellere til ineffektiv enfaktor-om-gangen (OFAT) testing11 eller bare nøye seg med den første formuleringen som tilfredsstiller spesifikasjonene.
I denne artikkelen presenteres en arbeidsflyt som bruker statistisk programvare for å optimalisere et generisk LNP-formuleringsproblem, som adresserer design- og analyseproblemer i den rekkefølgen de vil bli møtt. Faktisk vil metoden fungere for generelle optimaliseringsproblemer og er ikke begrenset til LNP. Underveis blir flere vanlige spørsmål som dukker opp adressert og anbefalinger gitt som er forankret i erfaring og i simuleringsresultater12. Det nylig utviklede rammeverket av selvvaliderte ensemblemodeller (SVEM)13 har forbedret den ellers skjøre tilnærmingen til å analysere resultater fra blandingsprosesseksperimenter, og vi bruker denne tilnærmingen til å gi en forenklet strategi for formuleringsoptimalisering. Mens arbeidsflyten er konstruert på en generell måte som kan følges ved hjelp av andre programvarepakker, er JMP 17 Pro unik i å tilby SVEM sammen med de grafiske sammendragsverktøyene som vi har funnet å være nødvendige for å forenkle den ellers uforståelige analysen av blandingsprosesseksperimenter. Som et resultat er JMP-spesifikke instruksjoner også gitt i protokollen.
SVEM bruker det samme lineære regresjonsmodellgrunnlaget som den tradisjonelle tilnærmingen, men det tillater oss å unngå kjedelige modifikasjoner som kreves for å passe til en "full modell" av kandidateffekter ved å bruke enten en fremovervalg eller en straffet seleksjon (Lasso) basetilnærming. I tillegg gir SVEM en forbedret tilpasning av "redusert modell" som minimerer potensialet for å innlemme støy (prosess pluss analytisk varians) som vises i dataene. Det fungerer ved å beregne gjennomsnittet av de predikerte modellene som følge av gjentatte ganger å vekte den relative betydningen av hver kjøring i modellen 13,14,15,16,17,18. SVEM gir et rammeverk for modellering av blandingsprosesseksperimenter som både er enklere å implementere enn tradisjonell single-shot regresjon og gir bedre kvalitet optimal formulering kandidater12,13. De matematiske detaljene i SVEM er utenfor omfanget av denne artikkelen, og selv et overfladisk sammendrag utover den relevante litteraturgjennomgangen vil distrahere fra den største fordelen i denne applikasjonen: det tillater en enkel, robust og nøyaktig klikk-og-bruk-prosedyre for utøvere.
Den presenterte arbeidsflyten er i samsvar med Quality by Design (QbD)19-tilnærmingen til farmasøytisk utvikling20. Resultatet av studien vil være en forståelse av det funksjonelle forholdet som knytter materialattributtene og prosessparametrene til kritiske kvalitetsattributter (CQAs)21. Daniel et al.22 diskuterer bruk av et QbD-rammeverk spesielt for RNA-plattformproduksjon: arbeidsflyten vår kan brukes som et verktøy innenfor dette rammeverket.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>JMP Pro 17.1</td>
			<td>JMP Statistical Discovery LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a workflow for lipid nanoparticle (lnp) formulation optimization using designed mixture-process experiments and self-validated ensemble models (svem)

Vi presenterer en Quality by Design (QbD) stylet tilnærming for optimalisering av lipid nanopartikkel (LNP) formuleringer, med sikte på å tilby forskere en tilgjengelig arbeidsflyt. Den iboende begrensningen i disse studiene, hvor molforholdet mellom ioniserbare, hjelper- og PEG-lipider må legge opp til 100%, krever spesialiserte design- og analysemetoder for å imøtekomme denne blandingsbegrensningen. Med fokus på lipid- og prosessfaktorer som ofte brukes i LNP-designoptimalisering, tilbyr vi trinn som unngår mange av vanskelighetene som tradisjonelt oppstår i design og analyse av blandingsprosesseksperimenter ved å bruke romfyllingsdesign og utnytte det nylig utviklede statistiske rammeverket for selvvaliderte ensemblemodeller (SVEM). I tillegg til å produsere kandidatoptimale formuleringer, bygger arbeidsflyten også grafiske sammendrag av de monterte statistiske modellene som forenkler tolkningen av resultatene. De nylig identifiserte kandidatformuleringene vurderes med bekreftelseskjøringer og kan eventuelt gjennomføres i sammenheng med en mer omfattende andrefasestudie.

Denne tilnærmingen har blitt validert på tvers av begge bredt klassifiserte lipidtyper: MC3-lignende klassiske lipider og lipidoider (f.eks. C12-200), generelt avledet fra kombinatorisk kjemi. Sammenlignet med en benchmark LNP-formulering utviklet ved hjelp av en One Factor at a Time (OFAT) -metode, viser kandidatformuleringene generert gjennom vår arbeidsflyt ofte potensforbedringer på 4 til 5 ganger på en logaritmisk skala, som vist i museleverens luciferaseavlesninger i figur 18. <st...

Watch this Scientific Journal Video about A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM at JoVE.com

A Workflow for Lipid Nanoparticle LNP Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models SVEM

Denne protokollen gir en tilnærming til formuleringsoptimalisering over blandings-, kontinuerlige og kategoriske studiefaktorer som minimerer subjektive valg i den eksperimentelle designkonstruksjonen. For analysefasen benyttes en effektiv og brukervennlig modelleringstilpasningsprosedyre.

En arbeidsflyt for optimalisering av lipidnanopartikler (LNP) formulering ved bruk av designede blandingsprosesseksperimenter og selvvaliderte ensemblemodeller (SVEM)

We present a Quality by Design (QbD) styled approach for optimizing lipid nanoparticle (LNP) formulations, aiming to offer scientists an accessible ...

Denne artikkelen gir en arbeidsflyt for forskere å konstruere en eksperimentell designtabell og analysere eksperimentelle resultater over en rekke blandings- og prosessfaktorer, uten å kreve kjedelige og potensielt flyktige statistiske beslutninger. De resulterende modellene kan optimaliseres i fellesskap over flere svar og brukes til å produsere informativ grafikk for å oppsummere både den felles responsflaten og prediksjonene av de individuelle svarene. Denne grafikken er enklere å tolke enn parameterestimatene fra de underliggende statistiske modellene, og er nyttige for å representere faktorinnstillingene som gir de mest ønskelige svarene.Lipid- og nanopartikkelformuleringsforskere trenger ofte å konstruere nye oppskrifter for forskjellige nyttelaster eller når de endrer lipider eller prosessinnstillinger. Vi tilbyr en robust tilnærming til formuleringsoptimalisering som minimerer potensialet for feil i designkonstruksjon, og unngår behovet for omfattende statistikk og kunnskap under analyse. Oppsummer formålet med eksperimentet i et datostemplet dokument.Oppgi svarene som skal måles under eksperimentet. Velg faktorene som vil bli variert og de som vil bli holdt konstant under studien. Etabler områdene for de forskjellige faktorene og den relevante desimalpresisjonen for hver.Bestem studiedesignstørrelsen ved hjelp av minimum og maksimum heuristikk. Åpne hopp og naviger i menylinjen til DOI, Special Purpose, Space Filling Design. Skriv inn studiesvarene.Skriv inn studiefaktorene og områdene. Skriv inn det forhåndsbestemte antallet kjøringer for designet. Generer designtabellen for plassfylling for de valgte faktorene og kjørestørrelsen.Legg til en notatkolonne i tabellen for å legge til merknader i manuelt opprettede kjøringer. Hvis det er aktuelt, kjøres manuelt innlemme referansekontroll i utformingstabellen. Inkluder en replikat for en av de kontrollerte referanseverdiene.Merk referansenavnet i notatkolonnen og fargekode referanseindeksen replikere rader for enkel identifisering. Rund blandingen av faktornivåer til riktig granularitet. Kopier de avrundede verdiene og lim dem inn i de opprinnelige kolonnene.Slett de overflødige kopiene av de avrundede kolonnene. Etter avrunding av lipidfaktorene, kontroller at summen er lik 100%Hvis en hvilken som helst radsum ikke er lik en, justerer du en av blandingsfaktorene manuelt, slik at den holder seg innenfor faktorområdet. Slett sumkolonnen etter at justeringene er gjort.Følg samme prosedyre som brukes for avrunding av blandingsfaktorene for å runde prosessfaktorene til deres respektive granularitet. Formater lipidkolonnene slik at de vises som prosentdeler med ønsket antall desimaler. Hvis du har lagt til manuelle kjøringer, for eksempel referansemålinger, rerandomiserer du tabellradrekkefølgen og legger til en ny kolonne med avrundede verdier.Sorter denne kolonnen i stigende rekkefølge ved å høyreklikke på kolonneoverskriften, og slett deretter kolonnen. Generer ternære tomter for å visualisere designpunktene over lipidfaktorene. Undersøk også kjørefordelingen over prosessfaktorene.Formuleringsforskerne bør bekrefte gjennomførbarheten av alle løpene. Hvis det ikke finnes gjennomførbare kjøringer, start designet på nytt med tanke på de nylig oppdagede begrensningene. Kjør eksperimentet i den rekkefølgen som angis av utformingstabellen.Registrer avlesningene i kolonnen som er innebygd i den eksperimentelle tabellen. Plott avlesningene og undersøk fordelingen av svarene. Undersøk den relative avstanden mellom de fargekodede replikasjonskjøringene hvis en ble inkludert, dette gjør det mulig å forstå den totale prosessen og analytisk variasjon ved referanseindeksen, sammenlignet med variabiliteten på grunn av endringene i faktorinnstillingene over hele faktorrommet.Lag løpene på en ternær tomt. Fargelegg punktene i henhold til svarene for å få en modelluavhengig visning av oppførselen over blandingsfaktorene. Høyreklikk på en av de resulterende grafene, velg Radforklaring og velg deretter svarkolonnen.Gjenta dette for hvert svar. Bygg en uavhengig modell for hvert svar som en funksjon av studiefaktorene. Slett modellskriptene som ble opprettet av utformingen for plassfyll.Velg Analyser, tilpass modell. Konstruer en fullstendig modell som omfatter alle kandidateffekter. Denne modellen bør inkludere hovedeffektene av hver faktor, to- og treveis interaksjoner, kvadratiske og partielle kubiske termer i prosessfaktorene og Scheffe kubiske termer for blandingsfaktorene.Velg alle studiefaktorene. Endre oppføringen for grad til tre fra standardverdien to. Velg deretter en faktoriell til grad.Velg bare ikke-blandingsfaktorene, og velg deretter Makroer, Delvis kubisk. Velg bare blandingsfaktorene, og velg deretter Makroer, Scheffe Cubic. Deaktiver standardalternativet ingen avskjæring.Spesifiser svarkolonnen, endre Personlighet til Generalisert regresjon. Lagre dette modelloppsettet i datatabellen for enkel tilbakekalling. Velg Lagre i datatabell.Klikk Kjør. For estimeringsmetode velger du SVEM Forward Selection. Utvid menyene Advanced Controls Force Terms og fjern merket i boksene som tilsvarer blandingens hovedeffekter.Bare Intercept-termen vil forbli kontrollert. Klikk Go.Plot de faktiske svarene etter deres forventede svar fra SVEM-modellen for å bekrefte en rimelig forutsigbarhet. Klikk på den røde trekanten ved siden av SVEM Forward Selection (Lagre kolonner, Save Prediction Formula).Dette oppretter en ny kolonne som inneholder prediksjonsformelen i datatabellen Gjenta modellbyggingstrinnene for hvert svar. Når alle svarene har prediksjonskolonner lagret i datatabellen, tegner du svarsporene for alle de forutsagte svarkolonnene ved hjelp av en profileringsfunksjon. Velg Graph Profiler, og velg alle prediksjonskolonnene som ble opprettet i forrige trinn for formelen Y prediction, og klikk OK.Identifiser kandidatens optimale formuleringer. Angi ønskelighetsfunksjonen for hvert svar om det skal maksimeres, minimeres eller tilpasses et mål. Dette innebærer også å sette de relative viktighetsvektene for hvert svar.Hvis du vil generere den første kandidaten, angir du eventuelle primære svar til bruk viktighetsvekt 1,0 og eventuelle sekundære svar til å bruke viktighetsvekt 0,2. Be profileringen om å finne de optimale faktorinnstillingene som maksimerer ønskelighetsfunksjonen. Velg Ønskelig optimalisering, Maksimer ønskelighet.Registrer de optimale faktorinnstillingene sammen med en merknad om viktighetsvektingene som brukes for hvert svar. For kategoriske faktorer som ioniserbar lipidtype, finn de betinget optimale formuleringene for hvert faktornivå. Først angir du ønsket nivå for hver faktor i profileren.Hold deretter kontrolltasten og venstreklikk inne i grafen til den faktoren og velg Lås faktorinnstilling. Dette velger optimalisering og ønskelighet, maksimere ønskeligheten for å finne den betingede optimale med denne faktoren låst i sin nåværende innstilling. Når du er ferdig, låser du opp faktorinnstillingene før du fortsetter.Gjenta optimaliseringsprosessen etter å ha endret viktighetsvektene til svaret, kanskje bare optimalisere de primære svarene eller sette noen av de sekundære svarene til å ha mer eller mindre viktighetsvekt, ved å sette målet til ingen. Registrer den nye optimale kandidaten. Lag grafiske sammendrag av de optimale områdene i faktorrommet.Opprett en datatabell som inneholder 50 000 rader som er fylt med tilfeldig genererte faktorinnstillinger innenfor det tillatte faktorrommet, sammen med de tilsvarende predikerte verdiene fra de reduserte modellene for hvert av svarene, samt funksjonen for felles ønskelighet. Velg Tilfeldig utdatatabell. Endre verdien på hvor mange løp som skal simuleres, til 50 000, og klikk OK.I den nyopprettede tabellen legger du til en ny kolonne som beregner persentilen til ønskekolonnen. Bruk denne persentilkolonnen i ternærplottene i stedet for den rå ønskelighetskolonnen. Høyreklikk kolonneoverskriften Ønskelighet og velg Ny formelkolonne, Distribusjon, Kumulativ sannsynlighet.Generer følgende grafikk. Endre fargevalget for grafikken gjentatte ganger for å vise prognosene for hvert svar og for kolonnen for kumulativ sannsynlighet. Konstruer ternære tomter for de fire lipidfaktorene.I tabellen navigerer du til grafen ternær plott. Velg blandingsfaktorene for X-plotting, og klikk OK. Høyreklikk i en av de resulterende grafene, velg Radforklaring, og velg deretter kolonnen for forventet svar.Endre rullegardinmenyen for farger til Jet. Dette vil vise de beste og dårligste resultatene med hensyn til lipidfaktorene. Den nåværende figuren viser persentilene av felles ønskelighet når man vurderer å maksimere potens med viktig oppfølger til 1, og minimere størrelsen med viktig oppfølger til 0,2.Mens gjennomsnitt over faktorer som ikke vises på den ternære plottaksen. Endre fargevalget for grafikken gjentatte ganger for å vise forutsigelsene for hvert svar. På samme måte plotter du de 50.000 fargekodede punktene som representerer unike formuleringer mot de ikke-blandede prosessfaktorene enten entall eller i fellesskap, og ser etter forhold mellom responsene og faktorene.Se etter faktorinnstillingene som gir poengene som gir høyest ønskelighet. Denne figuren viser den felles ønskeligheten av alle formuleringene som kan dannes med hver av de tre ioniserte lipidtyper. De mest ønskelige formuleringene bruker H102, med H101 som gir noen potensielt konkurransedyktige alternativer.Utforsk ulike kombinasjoner av faktorer som kan føre til ulike reaksjoner. Lagre prediksjonsprofileringen og de huskede innstillingene tilbake i datatabellen. Forbered en tabell som viser de optimale kandidatene som er identifisert tidligere.Inkluder referansekontrollen med settet med kandidatkjøringer som skal formuleres og måles. Hvis noen av formuleringene fra eksperimentet ble funnet å gi ønskelige resultater, kanskje ved å overgå referanseindeksen, velg det beste for å legge til kandidattabellen og test på nytt sammen med nye formuleringer. Høyreklikk på tabellen for huskede innstillinger i profileren og velg Lag til datatabell.Gjennomfør bekreftelseskjøringene, konstruer formuleringene og samle avlesningene. Sammenlign ytelsen til kandidatens optimale formuleringer. Arbeidsflyten har blitt brukt i mange applikasjoner.I de fleste tilfeller har vi observert minst fire til fem ganger forbedring i potens når vi sammenligner med referanseformuleringer som er satt ved hjelp av en faktor om gangen optimalisering. Forbedringer er spesielt merkbare når sekundære svar er felles målrettet. Det er også mulig å bruke simulering for å vise forventet kvalitet på de optimale kandidatene produsert av denne prosedyren.Ved å bruke en kjent datagenereringsfunksjon for eksempeleksperimentet beskrevet i papiret, kan vi sammenligne kvaliteten på kandidatens optimale formuleringer hentet fra romfyllingsdesignene og SVEM-basert analyse som brukes i denne arbeidsflyten med de som er oppnådd fra de tradisjonelle blandingsanalyseteknikkene. Med kvaliteten på optimal formulering vist på den vertikale aksen og antall løp i designet vist på den horisontale aksen, representerer de blå punktene ytelsen til den ureduserte fulle statistiske modellen over 150 simuleringer. De gule punktene representerer ytelsen til det tradisjonelle enkeltskuddet fremovervalg basert på AICC-objektivfunksjonen.De grønne punktene representerer ytelsen til den SVEM-baserte tilnærmingen for fremovervalg som brukes i denne arbeidsflyten. SVEM-analysen gjør at vi får bedre optimale kandidater og færre løp. Det vil være sporadiske studier med ekstra kompleksitet som krever hjelp av en statistiker for design og analyse.Studier som er ekstremt høyt prioritert, hvor løpestørrelsen er mer begrenset enn vanlig, eller det er et stort antall kategoriske faktorer, eller en enkelt kategorisk faktor med et stort antall nivåer, kan tilnærmes annerledes av en statistiker. Bruk av enten optimale eller hybride design i stedet for plassfyllingsdesignet som er spesifisert i arbeidsflyten.

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Workflow for Lipid Nanoparticle (LNP) Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models (SVEM)

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A fra Gram-negative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Conducting Miller-Urey Experiments

Gjennomføre Miller-Urey Eksperimenter

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimalisering av Syntetisk Proteiner: Identifisering av Interpositional Avhengig Hente Strukturelt og / eller Funksjonelt Koblede Rester

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

Innkapsling av kreft Terapeutisk Agent dacarbazine Bruke Nanostrukturerte Lipid Carrier

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR spektroskopi som et robust verktøy for rask evaluering av Lipid profil av fiskeolje kosttilskudd

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Målinger av langtrekkende elektronisk sammenhenger under Femtosecond Diffraksjon eksperimenter utført på nanokrystaller av Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Væske-celle overføring elektronmikroskop for sporing selvstendig montering av nanopartikler

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Synthesis of Platinum-nickel Nanowires and Optimization for Oxygen Reduction Performance

Syntese av Platinum-nikkel Nanowires og optimalisering for oksygen ytelse

Platinum-nickel (Pt-Ni) nanowires were developed as fuel cell electrocatalysts, and were optimized for the performance and durability in the oxygen ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rask Nanoprobe Signal forsterkning av i Situ gull hydrogenion syntese

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Analyse av mineraler produsert av hFOB 1,19 og Saos-2 celler ved hjelp av overføring elektronmikroskop med energi dispersiv X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...